施敏，馬曉彤，曹學(xué)麗，裴海閏，韓天，鄭積敏

芍藥是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，具有多種藥理作用[1]，廣泛應(yīng)用于保健食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[2]。芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷是其中主要的活性成分[3]，但兩者在藥理作用上有較明顯差別[4]。芍藥內(nèi)酯苷具有抗抑郁作用[5]，在促進(jìn)睡眠、保護(hù)腦神經(jīng)的藥理活性甚至超過(guò)了芍藥苷[6]，此外其在鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、調(diào)節(jié)免疫力、舒張平滑肌、抗炎、殺滅病原微生物和保護(hù)肝臟方面具有顯著作用[7]。芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷互為同分異構(gòu)體[8]，且在大多數(shù)芍藥品種中，芍藥苷的含量顯著高于芍藥內(nèi)酯苷[9]。在芍藥內(nèi)酯苷抗抑郁藥物的研發(fā)中，不僅需要采用高效的分離手段對(duì)兩者進(jìn)行分離，分離出來(lái)的芍藥苷棄之不用造成資源的大量浪費(fèi)[10]。所以，我們想到如果能利用微生物轉(zhuǎn)化的方法將芍藥苷轉(zhuǎn)化為芍藥內(nèi)酯苷，一方面可以降低雙苷分離的難度，另一方面可以極大地提高資源的綜合利用度。目前，這方面的研究較少，劉鑫鑫等[11]曾對(duì)芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的微生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行過(guò)初步研究。從 18 種真菌中篩選出分別對(duì)芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷具有轉(zhuǎn)化能力的菌株，其中短刺小克銀漢霉（Cunninghamella blakesleeanaAS 3.910）、雅致小克銀漢霉、華根霉可以將芍藥苷轉(zhuǎn)化為芍藥內(nèi)酯苷，但并沒(méi)有深入研究各個(gè)菌種的轉(zhuǎn)化能力。本研究在此基礎(chǔ)上，就真菌短刺小克銀漢霉轉(zhuǎn)化芍藥苷為芍藥內(nèi)酯苷的影響因素進(jìn)行了系統(tǒng)考察，以芍藥苷的轉(zhuǎn)化率和芍藥內(nèi)酯苷的產(chǎn)率為考察指標(biāo)，對(duì)轉(zhuǎn)化工藝進(jìn)行了優(yōu)化。構(gòu)建了較高效的微生物轉(zhuǎn)化體系，提高了短刺小克銀漢霉對(duì)芍藥苷的轉(zhuǎn)化能力，為進(jìn)一步研究奠定了良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 短刺小克銀漢霉干粉購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)為 CICC40267。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：馬鈴薯提取液（取新鮮去皮馬鈴薯 200 g，切成小塊，加水 1.0 L，煮沸 30 min，濾去馬鈴薯塊，將濾液補(bǔ)至 1.0 L）1.0 L、葡萄糖 20.0 g、瓊脂15.0 g、自然 pH，121 ℃ 滅菌 15 min，放置于干凈的工作臺(tái)中，常溫冷卻凝固。 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：馬鈴薯提取液 100 ml、葡萄糖 2 g、自然 pH，121 ℃ 滅菌 15 min[12]。

1.1.3 底物 純度為 96% 的芍藥苷粉末由實(shí)驗(yàn)室自行制備，配制成 10 mg/ml 的底物甲醇溶液。

1.1.4 試劑 馬鈴薯（市售）；葡萄糖、氯化鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醇、正丁醇、正己烷均為分析純，購(gòu)于北京化工廠；煙酸（國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；蛋白胨購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；甲醇為色譜級(jí)，購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.1.5 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀為美國(guó)安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；HZQ-F160 全溫振蕩培養(yǎng)箱為蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；MJP-250 霉菌培養(yǎng)箱為上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；1312 SCL 超凈臺(tái)為北京賽伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；MLS-3020 高壓蒸汽滅菌鍋為日本Sanyo 電器集團(tuán)產(chǎn)品；FiveEasy Plus pH 計(jì)為梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；D-3750 離心機(jī)為美國(guó) Sigma公司產(chǎn)品；UB202i 正置生物顯微鏡為重慶奧浦光電技術(shù)有限公司產(chǎn)品；XB.K.25 血球計(jì)數(shù)板為上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化與菌種孢子液的制備 將購(gòu)買的短刺小克銀漢霉（AS3.910）菌種干粉用 5 ml 無(wú)菌水溶解，接種于馬鈴薯培養(yǎng)基上，在溫度為 28 ℃ 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌體產(chǎn)生明顯的菌絲，然后再將菌絲接入新的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，活化 3 次后得到活力較為旺盛的菌體。活化后的菌體，接種至馬鈴薯平板培養(yǎng)基上，在 28 ℃ 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌絲生長(zhǎng)旺盛且孢子豐富的時(shí)候，取出培養(yǎng)基，用20 ml 無(wú)菌水將平板上的孢子沖洗到無(wú)菌的三角瓶中，制成孢子液[13]。然后通過(guò)血球計(jì)數(shù)法，計(jì)數(shù)孢子液中的孢子個(gè)數(shù)[14]，從而確定接種量。

1.2.2 芍藥苷的轉(zhuǎn)化對(duì)照實(shí)驗(yàn) 設(shè)定 1 個(gè)實(shí)驗(yàn)組 1（菌體+ 芍藥苷底物 + 基礎(chǔ)培養(yǎng)基），將孢子液轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)化瓶中（250 ml 的錐形瓶中裝 100 ml 的發(fā)酵培養(yǎng)基），采用振蕩培養(yǎng)的方式，在 28 ℃ 培養(yǎng) 72 h；然后加入 10 mg/ml的芍藥苷甲醇溶液 1 ml，使藥物濃度為 1 mg/ml，轉(zhuǎn)化反應(yīng)持續(xù) 192 h。加入底物后，每隔 24 小時(shí)取 1 ml 的發(fā)酵液（菌體經(jīng) HPLC 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)并無(wú)芍藥苷與芍藥內(nèi)酯苷），7000 r/min 離心 10 min，取上清液，過(guò)濾后，進(jìn)行 HPLC 分析。初步考察菌體的轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)率及轉(zhuǎn)化時(shí)間。同時(shí)設(shè)計(jì)2 個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)：對(duì)照組 1（菌體 + 基礎(chǔ)培養(yǎng)基），考察菌體僅在培養(yǎng)基存在下，是否產(chǎn)生芍藥內(nèi)酯苷；對(duì)照組 2（芍藥苷底物 + 基礎(chǔ)培養(yǎng)基），考察芍藥苷底物在培養(yǎng)基中是否自動(dòng)轉(zhuǎn)化成芍藥內(nèi)酯苷。實(shí)驗(yàn)組的實(shí)驗(yàn)條件也是單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)發(fā)酵條件。

1.2.3 轉(zhuǎn)化效果的評(píng)價(jià)方法 HPLC 分析條件：色譜柱為Zorbax SB-C18（200 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇:0.2% 磷酸水 = 30:70（V/V）；流速 1 ml/min；洗脫時(shí)間 10 min；柱溫 30 ℃；進(jìn)樣量 10 μl；檢測(cè)波長(zhǎng) 230 nm。轉(zhuǎn)化效果用芍藥內(nèi)酯苷的產(chǎn)率和芍藥苷的轉(zhuǎn)化率雙指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。分別建立芍藥苷與芍藥內(nèi)酯苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定轉(zhuǎn)化前后芍藥苷與芍藥內(nèi)酯苷的濃度。計(jì)算公式如下：

式中，Ca1為芍藥內(nèi)酯苷轉(zhuǎn)化前的濃度；Ca2為芍藥內(nèi)酯苷轉(zhuǎn)化后的濃度；CP1為芍藥苷轉(zhuǎn)化前的濃度；CP2為芍藥苷轉(zhuǎn)化后的濃度。

1.2.4 影響轉(zhuǎn)化效果的單因素實(shí)驗(yàn) 在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，本研究考察了添加不同的輔助成分蛋白胨（1、2、3、4、5 g/L）、無(wú)機(jī)鹽 NaCl（1、2、3、4、5 g/L）、煙酸（0.1、0.2、0.4、0.5、0.6 g/L）等和不同培養(yǎng)條件，如最適 pH（4、5、6、7、8），轉(zhuǎn)化時(shí)間（24、48、72、96、120、144、168、192 h），底物溶媒（甲醇、50% 甲醇-水、水、乙醇），搖床轉(zhuǎn)速（150、200、250、300 r/min），接種量（1%、3%、5%、7%）、底物濃度（0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g/L）以及菌株培養(yǎng)時(shí)間（24、36、48、60、72、84 h）對(duì)產(chǎn)率及轉(zhuǎn)化率的影響。

1.2.5 轉(zhuǎn)化條件的正交試驗(yàn)優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定菌種培養(yǎng)時(shí)間、底物濃度、蛋白胨濃度、煙酸濃度作為正交實(shí)驗(yàn)的 4 個(gè)因素，每個(gè)因素各自選擇 3 個(gè)水平，忽略因素之間的相互作用，采用 L9(34) 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表 1）確定最佳轉(zhuǎn)化條件。

表1 芍藥苷轉(zhuǎn)化條件的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

首先對(duì)芍藥苷與芍藥內(nèi)酯苷的對(duì)照品進(jìn)行檢測(cè)，得到 HPLC 色譜圖（圖 1），由圖可知芍藥苷的出峰時(shí)間為6.4 min，芍藥內(nèi)酯苷的出峰時(shí)間為 4.4 min。

圖1 芍藥內(nèi)酯苷（1）和芍藥苷（2）對(duì)照品的 HPLC 圖

分別配制不同濃度梯度的芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷，利用HPLC 測(cè)定不同濃度下的芍藥苷與芍藥內(nèi)酯苷的峰面積，建立兩者的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖 2 和圖 3）。

圖2 芍藥內(nèi)酯苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 芍藥苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組轉(zhuǎn)化前后的樣品進(jìn)行分析。由對(duì)照組 1 的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，短刺小克銀漢霉不能在沒(méi)有底物的情況下自行代謝出芍藥內(nèi)酯苷，轉(zhuǎn)化菌體的發(fā)酵產(chǎn)物和培養(yǎng)基的殘留成分對(duì)轉(zhuǎn)化結(jié)果不會(huì)有影響（圖 4）；根據(jù)對(duì)照組 2 的結(jié)果，芍藥苷不能在無(wú)菌種的發(fā)酵液中直接轉(zhuǎn)化為芍藥內(nèi)酯苷，發(fā)酵液中不存在非生物對(duì)該轉(zhuǎn)化反應(yīng)的干擾（圖 5）；實(shí)驗(yàn)組 1 的結(jié)果表示在菌體、底物和培養(yǎng)基共存時(shí)，該菌體具有將芍藥苷轉(zhuǎn)化為芍藥內(nèi)酯苷的作用（圖 6）。

圖4 對(duì)照組 1（菌體 + 培養(yǎng)基）的 0 h 取樣（A）與168 h 取樣（B）的 HPLC 色譜圖

圖5 對(duì)照組 2（底物 + 培養(yǎng)基）的 0 h 取樣（A）與168 h 取樣（B）HPLC 圖（1：芍藥內(nèi)酯苷；2：芍藥苷）

通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)組 1 不同培養(yǎng)時(shí)間的取樣分析（圖 7）可見(jiàn)，隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間的延長(zhǎng)，芍藥內(nèi)酯苷的產(chǎn)率和芍藥苷的轉(zhuǎn)化率均不斷提高，在 168 h 達(dá)到產(chǎn)率（5.43 ± 0.12）% 與轉(zhuǎn)化率（11.39 ± 0.38）% 的高值，之后出現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，初步確定轉(zhuǎn)化時(shí)間為 168 h。

2.3 單因素對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響

圖6 實(shí)驗(yàn)組 1（菌體 + 底物 + 培養(yǎng)基）0 h 取樣（A）與 168 h 取樣（B）HPLC 色譜圖（1：芍藥內(nèi)酯苷；2：芍藥苷）

圖7 實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間的取樣結(jié)果

2.3.1 培養(yǎng)基的影響 氮源、無(wú)機(jī)鹽和維生素等培養(yǎng)基成分會(huì)對(duì)菌體轉(zhuǎn)化能力產(chǎn)生一定的影響[15]，本研究主要考察了不同的蛋白胨濃度、NaCl 濃度、煙酸濃度下菌體的轉(zhuǎn)化能力，結(jié)果見(jiàn)圖 8 ～ 圖 10。從結(jié)果可知，在蛋白胨濃度為4 g/L，NaCl 濃度為 2 g/L，煙酸濃度為 0.3 g/L 時(shí)菌體有較好的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率，其中蛋白胨濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率的影響較大。添加蛋白胨可以大幅提高轉(zhuǎn)化率，從（11.39 ±0.38）% 提高至（26.05 ± 1.52）%，但濃度過(guò)高時(shí)，轉(zhuǎn)化率有下降的趨勢(shì)。說(shuō)明蛋白胨是短刺小克銀漢霉必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但對(duì)其添加量需要嚴(yán)格控制。

2.3.2 菌株的影響

2.3.2.1 菌株培養(yǎng)時(shí)間的影響 菌株培養(yǎng)時(shí)間指加入底物前菌種的培養(yǎng)時(shí)間[16]。菌體生長(zhǎng)時(shí)間較短，由于還沒(méi)生長(zhǎng)到生長(zhǎng)代謝最旺盛的對(duì)數(shù)期，密度不夠，轉(zhuǎn)化率較低。菌種生長(zhǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，密度雖然高，但菌體活力降低，故要選擇合適的菌株培養(yǎng)時(shí)間[17]。在發(fā)酵液接種后，分別在培養(yǎng) 24、36、48、60、72、84 h 再加底物，考察菌株培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果（圖 11）表明培養(yǎng)時(shí)間為 60 h 有較高的產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率。

圖8 培養(yǎng)基中蛋白胨濃度對(duì)菌株轉(zhuǎn)化能力的影響

圖9 培養(yǎng)基中 NaCl 濃度對(duì)菌株轉(zhuǎn)化能力的影響

圖10 培養(yǎng)基中煙酸濃度對(duì)菌株轉(zhuǎn)化能力的影響

2.3.2.2 菌株接種量的影響 菌種的添加比例對(duì)微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化有很大的影響[18]，主要影響微生物轉(zhuǎn)化啟動(dòng)的時(shí)間[19]。將 28 ℃ 培養(yǎng) 7 d 的平板，用無(wú)菌水制成孢子懸浮液[20]，調(diào)整濃度，通過(guò)血球計(jì)數(shù)法得到濃度為 2 × 106個(gè)/ml的孢子原液。向 100 ml 的發(fā)酵液中加入 0.5、1.5、2.5 和3.5 ml 的孢子原液，達(dá)到設(shè)定接種量 1%、3%、5%、7%，以此考察不同接種量對(duì)短刺小克銀漢霉轉(zhuǎn)化芍藥苷為芍藥內(nèi)酯苷能力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖 12。可以看出接種量為 3%時(shí)，有較好的轉(zhuǎn)化率與產(chǎn)率。

圖11 菌株培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響

圖12 不同接種量對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響

2.3.3 底物對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

2.3.3.1 底物濃度的影響 在微生物轉(zhuǎn)化體系中，底物濃度對(duì)菌體的轉(zhuǎn)化能力有著較明顯的影響[21]。所以，在基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化與發(fā)酵條件下，向 100 ml 發(fā)酵液中分別添加 1、1.5、2、2.5 和 3 ml 的 10 mg/ml 的底物甲醇混合液。結(jié)果見(jiàn)圖 13，在設(shè)定的底物濃度范圍內(nèi)，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0.15 g/L時(shí)，芍藥苷有較好的轉(zhuǎn)化率（19.87 ± 1.07）%。超過(guò) 0.15 g/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這表明轉(zhuǎn)化體系的轉(zhuǎn)化能力有限，也反映出底物的細(xì)胞毒性可能會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生抑制。

2.3.3.2 溶媒的影響 底物在發(fā)酵液中的溶解能力較低是微生物轉(zhuǎn)化效率較低的主要原因[22]，因此，本實(shí)驗(yàn)研究了不同溶媒對(duì)微生物轉(zhuǎn)化效率的影響。

由于有機(jī)溶劑對(duì)短刺小克銀漢霉的轉(zhuǎn)化能力有較大影響，分別用甲醇、50% 甲醇-水溶液、水以及乙醇等溶液溶解底物，考察不同溶媒對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果如圖 14 所示，用甲醇溶解底物，能使短刺小克銀漢霉有較好的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率，所以選定甲醇作為芍藥苷的溶媒。

圖13 底物濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響

圖14 溶媒對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響

2.3.4 發(fā)酵條件的影響

2.3.4.1 初始 pH 值的影響 pH 值的變化會(huì)引起菌體細(xì)胞通透性與酶活力的變化，并影響菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率，從而影響菌體的生長(zhǎng)及代謝活動(dòng)。適當(dāng)?shù)?pH 值將有利于短刺小克銀漢霉的菌體生長(zhǎng)及菌種活力[23]，同時(shí)影響轉(zhuǎn)化效率。因此考察不同 pH 值對(duì)短刺小克銀漢霉轉(zhuǎn)化芍藥苷轉(zhuǎn)化率與芍藥內(nèi)酯苷產(chǎn)率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖 15。在 pH為 6 時(shí)，該菌有較好的轉(zhuǎn)化能力。

圖15 培養(yǎng)基 pH 值對(duì)芍藥苷內(nèi)酯產(chǎn)率及芍藥苷轉(zhuǎn)化率的影響

2.3.4.2 轉(zhuǎn)速的影響 搖床轉(zhuǎn)速直接影響底物與菌體的接觸程度，同時(shí)影響催化反應(yīng)中氧氣的供給[24]，本實(shí)驗(yàn)考察了 150、200、250 和 300 r/min 4 個(gè)轉(zhuǎn)速條件下短刺小克銀漢霉對(duì)芍藥苷的轉(zhuǎn)化能力。由圖 16 可以看出，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為 250 r/min 時(shí)，該菌的催化效果最好，轉(zhuǎn)化率與產(chǎn)率較高；當(dāng)轉(zhuǎn)速為 150 r/min 時(shí)，催化反應(yīng)的氧氣供應(yīng)不足，造成轉(zhuǎn)化產(chǎn)率大幅度下降[25]；當(dāng)轉(zhuǎn)速為 300 r/min 時(shí)，該菌的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率也較低，可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)速過(guò)高，菌體的生長(zhǎng)與代謝受到較大影響，并且大部分的菌出現(xiàn)掛壁現(xiàn)象，從而影響了轉(zhuǎn)化率。所以，轉(zhuǎn)化的最適轉(zhuǎn)速為 250 r/min。

圖16 轉(zhuǎn)速對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，影響轉(zhuǎn)化效果的因素有很多。綜合考慮，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)培養(yǎng)基中的煙酸濃度、NaCl 濃度、培養(yǎng)基初始 pH 值、搖床轉(zhuǎn)速、底物溶媒、接種量等因素進(jìn)行了優(yōu)化定值，選取單因素條件下的最佳值作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)條件。對(duì)涉及菌種、培養(yǎng)基、底物和轉(zhuǎn)化條件 4 方面的關(guān)鍵影響因素，包括菌株培養(yǎng)時(shí)間、蛋白胨濃度、底物濃度和轉(zhuǎn)化時(shí)間 4 個(gè)因素進(jìn)行了進(jìn)一步正交試驗(yàn)優(yōu)化。

2.4 正交試驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 2，轉(zhuǎn)化效果最佳的條件：培養(yǎng)時(shí)間為 48 h，轉(zhuǎn)化時(shí)間的最好水平是 144 h，底物的最佳濃度為0.15 g/L，蛋白胨的最佳濃度為 5 g/L。

綜合單因素和正交試驗(yàn)的結(jié)果，得出最佳的轉(zhuǎn)化工藝條件為：蛋白胨濃度 5 g/L，NaCl 濃度 2 g/L，煙酸濃度0.3 g/L，菌種培養(yǎng)時(shí)間 48 h，接種量 3%，培養(yǎng)基 pH 6，轉(zhuǎn)速 250 r/min，轉(zhuǎn)化時(shí)間 144 h，底物濃度 0.15 g/L，甲醇作為底物的溶媒。在優(yōu)化的轉(zhuǎn)化工藝條件下，進(jìn)行 3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得短刺小克銀漢霉對(duì)芍藥苷的轉(zhuǎn)化率為（43.00 ±2.73）%，芍藥內(nèi)酯苷的產(chǎn)率為（9.29 ± 0.10）%。

3 結(jié)論

為了構(gòu)建一套高效的基于短刺小克銀漢霉的芍藥苷轉(zhuǎn)化芍藥內(nèi)酯苷的微生物轉(zhuǎn)化體系和工藝，考察了菌種、培養(yǎng)基、底物和轉(zhuǎn)化條件等 4 方面的影響因素，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了一套較為高效的轉(zhuǎn)化工藝條件。與基礎(chǔ)發(fā)酵條件下相比，在優(yōu)化體系和優(yōu)化的工藝條件下，芍藥苷的轉(zhuǎn)化率從（11.39 ± 0.38）% 提高至（43.00 ± 2.73）%，芍藥內(nèi)酯苷的產(chǎn)率從（5.43 ± 0.12）% 提升至（9.29 ±0.10）%，轉(zhuǎn)化效果有了顯著提高。但是芍藥內(nèi)酯苷的產(chǎn)率仍然較低，其中一個(gè)原因是在芍藥苷轉(zhuǎn)化為芍藥內(nèi)酯苷的過(guò)程中，有其他物質(zhì)的產(chǎn)生，芍藥內(nèi)酯苷并非唯一轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。要提高芍藥內(nèi)酯苷的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率還需進(jìn)一步研究其中起轉(zhuǎn)化作用的關(guān)鍵酶，并通過(guò)分子生物學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行代謝調(diào)控，提高其表達(dá)量和轉(zhuǎn)化活性。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的優(yōu)化結(jié)果

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