劉重慧,張 靜,范譽(yù)川,高兆蘭,魏 濤

(北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100191)

低聚異麥芽糖(isomaltooligosaccharide,IMO)又稱為異麥芽低聚糖、異麥芽寡糖、分枝低聚糖等,是淀粉糖的一種,主要成分為葡萄糖分子間以α-1,6糖苷鍵結(jié)合的異麥芽糖(Isomaltose)、潘糖(Panose)、異麥芽三糖(Isomaltotriose)等[1]。

低聚異麥芽糖具有良好的生理功能,能促進(jìn)腸道有益菌的增殖和所占比例,抑制腸道有害菌及腐敗物質(zhì)形成,低聚異麥芽糖可促進(jìn)益生菌產(chǎn)生短鏈脂肪酸[2-3]和短鏈有機(jī)酸,可降低腸道pH,促進(jìn)腸蠕動(dòng),改善便秘[4-5],增加維生素含量;促生的有益菌雙歧桿菌能夠產(chǎn)生B族維生素和煙酸、葉酸等人體必需的維生素,而腸道中短鏈脂肪酸的大量積累促進(jìn)了礦物質(zhì)如鈣、鐵、鎂等礦質(zhì)元素的吸收,提高機(jī)體免疫力[6]。低聚異麥芽糖還可調(diào)節(jié)人體脂類代謝,對(duì)總膽固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白的降低作用明顯[7]。低聚異麥芽糖還可預(yù)防直腸癌等癌癥的發(fā)生[8]等諸多功能。低聚異麥芽糖抗齲齒性甚佳,可以有效地保護(hù)牙齒。低聚異麥芽糖中潘糖對(duì)阻礙齒垢形成的效果也極為明顯[9]。低聚異麥芽糖是公認(rèn)的有發(fā)展前景的益生元,在食品、動(dòng)物飼料等方面已得到了極大的關(guān)注。但目前研究報(bào)道中涉及低聚異麥芽糖最佳含量的內(nèi)容較少。

本文旨在研究不同含量低聚異麥芽糖在體外對(duì)益生菌的生長(zhǎng)影響,對(duì)小鼠體內(nèi)腸道菌群的影響以及低聚異麥芽糖對(duì)便秘小鼠潤(rùn)腸通便的作用,同時(shí)研究了低聚異麥糖不同含量對(duì)益生菌的影響。以期為功能性食品開發(fā),動(dòng)物飼料添加劑的開發(fā),醫(yī)藥領(lǐng)域及低聚異麥芽糖分子水平作用機(jī)制的研究提供參考,同時(shí)為低聚異麥芽糖作用的最佳含量提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低聚異麥芽糖 山東百龍創(chuàng)園生物科技有限公司;復(fù)方地芬諾酯 常州康普藥業(yè)有限公司;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用二月齡的BALB/C 二級(jí)雌性小鼠,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心繁殖場(chǎng),體重在22～28 g之間共110只;長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus) 北京聯(lián)合大學(xué)食品科學(xué)系微生物實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)雙歧桿菌培養(yǎng)以BBL培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),嗜酸乳桿菌以MRS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);EMB培養(yǎng)基;疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂培養(yǎng)基;LBS瓊脂培養(yǎng)基。

BBL培養(yǎng)基:蛋白胨15.0 g/L,酵母粉2.0 g/L,葡萄糖20.0 g/L,可溶性淀粉0.5 g/L,氯化鈉5.0 g/L,5%半胱氨酸10.0 mL/L,西紅柿浸出液400.0 mL/L,吐溫801.0 mL/L,肝提取液80.0 mL/L,瓊脂 20.0 g/L,pH7.0,121 ℃滅菌15 min。

MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g/L,牛肉膏10.0 g/L,酵母浸出液5.0 g/L,K2HPO42.0 g/L,葡萄糖20.0 g/L,乙酸鈉5.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.58 g/L,吐溫80 1.0 mL/L,硫酸錳0.25 g/L,瓊脂20 g/L,pH6.2～6.4,121 ℃滅菌15 min。

EMB培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g/L,乳糖10.0 g/L,K2HPO42.0 g/L,2%伊紅Y溶液20 mL/L,0.65%美藍(lán)溶液10 mL/L,瓊脂17 g/L,pH7.1(將蛋白胨,磷酸鹽和瓊脂溶解于蒸餾水中,調(diào)整pH,分裝,121 ℃滅菌15 min。臨用時(shí)加入乳糖并加熱溶化瓊脂,冷卻至50～55 ℃,加入伊紅和美藍(lán)溶液,搖勻倒平板)。

疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂培養(yǎng)基:多價(jià)胨10.0 g/L,酵母浸膏5.0 g/L,氯化鈉5.0 g/L,K2HPO44.0 g/L,KH2PO41.5 g/L,疊氮化鈉0.5 g/L,七葉苷1.0 g/L,0.05%結(jié)晶紫水溶液0.4 mL,檸檬酸鐵銨0.5 g,瓊脂20 g/L,pH8.0,121 ℃滅菌15 min。

LBS培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g/L,牛肉膏10.0 g/L,酵母粉2.0 g/L葡萄糖20.0 g/L,吐溫801.0 mL/L,K2HPO42.0 g/L,乙酸鈉5.0 g/L,枸櫞酸三氨2.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,硫酸錳0.05 g/L,瓊脂2,5 g/L,pH6.0～6.5,121 ℃滅菌15 min。

JA2103N天平 北京東南儀誠(chéng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司;ZSD-1160多功能生化培養(yǎng)箱 TOKYO RIKAKIKAI CO.LTD;BX41顯微鏡 OLYMPUS;825-A型厭氧罐 沈陽市第五人民醫(yī)院;灌胃針 上海邦耀生物科技有限公司;微量加樣器 Eppendorf公司;GI54DWS高壓滅菌鍋 zealway公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 低聚異麥芽糖培養(yǎng)基設(shè)置 以上述BBL培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ),除葡萄糖成分外,其余成分含量均與BBL培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基相同,葡萄糖以表1內(nèi)的糖替代。

表1 低聚異麥芽糖在糖含量中所占的比例Table 1 The percentage of maltose in sugar content

1.2.2 活菌數(shù)的測(cè)定 取含有上述不同濃度低聚異麥芽糖的BBL、MRS液體培養(yǎng)基10 mL于20 mL試管中,將純化后的母種以5%的接種量分別接種,37 ℃培養(yǎng),長(zhǎng)雙歧桿菌置于厭氧罐中,培養(yǎng)16～24 h。嗜酸乳桿菌采用稀釋平板法計(jì)數(shù),長(zhǎng)雙歧桿菌采用液封法計(jì)數(shù)[10]。

1.2.3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)設(shè)置 所選用的小鼠均按體重隨機(jī)分組,腸道菌群實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對(duì)照組、低劑量組、高劑量組,每組10只,潤(rùn)腸通便和小鼠小腸推進(jìn)率實(shí)驗(yàn)分別設(shè)陰性對(duì)照組、模型對(duì)照組、低劑量組、高劑量組,每組10只。

受試樣品及飼喂劑量:低聚異麥芽糖的飼喂劑量采用0.5、1.0 g/(kg·bw)(人體推薦量5～10倍)作為低、高劑量[11]。采取灌胃法,每日灌胃一次,每次灌胃0.2 mL/(10 g·bw)。灌胃14 d,空白對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃等量蒸餾水[10]。

腸道微生物的采集與處理:實(shí)驗(yàn)中,給予受試物之前以及最后一次給予受試物后24 h,無菌條件下采取小鼠糞便,將其放入已滅菌的裝有3 mL稀釋液的試管中,稱重,振蕩混勻,待糞便完全均質(zhì)于稀釋液后,采取10倍系列稀釋。選擇合適的稀釋度分別接種在BBL培養(yǎng)基、EMB培養(yǎng)基、疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂培養(yǎng)基及LBS瓊脂培養(yǎng)基上。37 ℃培養(yǎng)24或48 h后,通過觀察菌落形態(tài),革蘭氏染色鏡檢并計(jì)數(shù)菌落[12],計(jì)算每克糞便中的雙歧桿菌、大腸桿菌、腸桿菌及乳桿菌的數(shù)量,取對(duì)數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn):在連續(xù)給予受試物21 d后,各組小鼠禁食24 h。實(shí)驗(yàn)開始前各劑量組給予對(duì)應(yīng)受試物,正常對(duì)照組及模型對(duì)照組給予等量蒸餾水。30 min后,除正常對(duì)照組外,其余各組灌喂復(fù)方地芬諾酯50 mg/(kg·bw)。20 min后,各組灌喂15%碳黑墨水0.5 mL/只。經(jīng)過20 min后,頸椎脫臼處死動(dòng)物,立即取出自幽門至盲腸部的整段小腸,不加牽引平鋪成直線。測(cè)量小腸全長(zhǎng)和幽門至墨水運(yùn)動(dòng)前沿位移,計(jì)算小腸推進(jìn)率[10]。

小腸推進(jìn)率(%)=墨水移動(dòng)距離(cm)/小腸全長(zhǎng)(cm)×100

小鼠排便實(shí)驗(yàn):在連續(xù)給予受試物21 d 后,各組小鼠禁食24 h。除正常對(duì)照組外,其余各組灌胃復(fù)方地芬諾酯10 mg/(kg·bw)。將小鼠放入鼠籠單獨(dú)飼養(yǎng),正常飲水進(jìn)食。1 h后給各組小鼠灌胃15%碳黑墨水0.5 mL/只(實(shí)驗(yàn)組碳黑墨水含相應(yīng)劑量的受試物)。觀察記錄每只小鼠自灌胃復(fù)方地芬諾酯起的首黑便時(shí)間以及6 h內(nèi)排便重量[10]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度梯度低聚異麥芽糖在體外對(duì)腸道菌群增殖的影響

2.1.1 對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌的影響 由表2可以看出,體外實(shí)驗(yàn)中采用不同濃度低聚異麥芽糖與葡萄糖培育長(zhǎng)雙歧桿菌,單位體積內(nèi)活菌數(shù)量發(fā)生變化。以50%、75%和100%低聚異麥芽糖替代葡萄糖培養(yǎng),與100%葡萄糖培養(yǎng)相比,單位體積內(nèi)長(zhǎng)雙歧桿菌Log CFU/mL顯著增加(p<0.05),分別增加5%、6%和8%。結(jié)果提示,50%、75%、100%低聚異麥芽糖在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌的增殖作用顯著。而25%低聚異麥芽糖替代葡萄糖,與100%葡萄糖培養(yǎng)相比對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌的生長(zhǎng)沒有顯著影響,出現(xiàn)此結(jié)果的原因可能是由于低聚異麥芽糖的含量過低導(dǎo)致對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌的作用影響不大,由數(shù)據(jù)結(jié)果可推測(cè)低聚異麥芽糖對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌的增殖作用可能呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。

表2 不同濃度低聚異麥芽糖在體外對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌的增殖作用Table 2 The effect of different concentrations of isomaltooligosaccharideon the proliferation of Bifidobacterium longum in log CFU/mL)

2.1.2 低聚異麥芽糖對(duì)嗜酸乳桿菌的影響 由表3可以看出,體外實(shí)驗(yàn)中采用不同濃度低聚異麥芽糖與葡萄糖培養(yǎng)嗜酸乳桿菌,單位體積內(nèi)活菌數(shù)量發(fā)生變化,以50%,75%和100%低聚異麥芽糖替代葡萄糖培養(yǎng),與100%葡萄糖培養(yǎng)相比,單位體積內(nèi)嗜酸乳桿菌Log CFU/mL分別增加5%(p<0.05),5.6%(p<0.05)和12.5%(p<0.01)。結(jié)果提示,50%,75%,100%低聚異麥芽糖在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)嗜酸乳桿菌的增殖作用顯著。而25%低聚異麥芽糖替代葡萄糖,與100%葡萄糖培養(yǎng)相比對(duì)嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)沒有顯著影響,出現(xiàn)此結(jié)果的原因可能是由于低聚異麥芽糖的含量過低導(dǎo)致對(duì)嗜酸乳桿菌的作用影響不大,由數(shù)據(jù)結(jié)果可推測(cè)低聚異麥芽糖對(duì)嗜酸乳桿菌的增殖作用可能呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。

表3 不同濃度低聚異麥芽糖在體外對(duì)嗜酸乳桿菌的增殖作用Table 3 The effect of different concentrations of aisomaltooligosaccharide on the proliferation of Lactobacillus acidophilus in CFU/mL)

2.2 低聚異麥芽糖對(duì)小鼠體重的影響

由表4可見,灌胃低、高劑量的低聚異麥芽糖后,與空白對(duì)照組相比,小鼠的體重變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明低聚異麥芽糖對(duì)生物體體重的增長(zhǎng)沒有明顯的作用效果,這與王少光[13]等的研究結(jié)果是一致的。

表4 低聚異麥芽糖對(duì)小鼠體重的影響Table 4 Effect of isomaltooligosaccharide on body weight in

2.3 低聚異麥芽糖對(duì)小鼠腸道菌群的影響

由表5可知,在灌胃前腸道菌群無差異的小鼠,連續(xù)給與低劑量組(0.5 mg/(kg·bw))、高劑量組(1.0 g/(kg·bw))低聚異麥芽糖14 d后,與對(duì)照組相比,高劑量組腸桿菌及腸球菌數(shù)量并無顯著變化,低劑量組腸球菌也沒有顯著變化,低劑量組腸桿菌則顯著降低。低,高劑量組乳桿菌及雙歧桿菌數(shù)量均有顯著提高,其中低劑量組腸桿菌減少6%(p<0.05),乳桿菌增長(zhǎng)5%(p<0.01),雙歧桿菌增長(zhǎng)9%(p<0.01);高劑量組的乳桿菌增長(zhǎng)9%(p<0.01),雙歧桿菌增長(zhǎng)11%(p<0.01)。灌胃前后自身的比較中,空白對(duì)照組腸球菌顯著增加14%(p<0.05),乳桿菌增長(zhǎng)10%(p<0.01);低劑量組腸桿菌減少14%(p<0.05),乳桿菌增長(zhǎng)12%(p<0.05),雙歧桿菌增長(zhǎng)15%(p<0.01);高劑量組乳桿菌增長(zhǎng)21%(p<0.01),雙歧桿菌增長(zhǎng)19%(p<0.01)。說明低聚異麥芽糖可促進(jìn)乳桿菌,雙歧桿菌等腸道有益菌的增長(zhǎng),同時(shí)抑制腸球菌等有害菌的增長(zhǎng),對(duì)腸道菌群具有較強(qiáng)的良性調(diào)節(jié)作用,但低、高兩個(gè)劑量組對(duì)腸道菌群的影響差別不大。

表5 低聚異麥芽糖對(duì)小鼠腸道菌群的影響Table 5 Effect of isomaltooligosaccharide on intestinal flora in CFU/g)

糞便中雙歧桿菌與腸桿菌數(shù)量的比值(B/E值)可作為腸道微生物定植抗力的指標(biāo)應(yīng)用于臨床,該指標(biāo)能從正反兩個(gè)方面來評(píng)價(jià)腸道菌群結(jié)構(gòu)的狀況,B/E值1以上表示腸道定植抗力正常,B/E值<1表示腸道定植抗力降低[14]。由表6可見,在飼喂受試物前后,各組小鼠的B/E值均大于1,說明小鼠腸道定植力正常。在飼喂前,各組小鼠B/E值無顯著差異。服用低聚異麥芽糖14 d后,對(duì)照組的B/E值與飼喂前沒有差異,低、高劑量組與飼喂前相比分別提高23%(p<0.05)和32%(p<0.01);與對(duì)照組相比,分別提高10%(p<0.05)和19%(p<0.01)。表5,表6的結(jié)果提示,低、高劑量的低聚異麥芽糖具有可以改善腸道菌群結(jié)構(gòu)的功能。

表6 低聚異麥芽糖對(duì)小鼠腸道菌群B/E的影響Table 6 Effect of isomaltooligosaccharide on intestinal flora B/E in

2.4 對(duì)小鼠小腸推進(jìn)率的影響

由表7可以看出,連續(xù)給與受試物21 d后,陰性對(duì)照組的小腸推進(jìn)率高于模型對(duì)照組90%(p<0.01),說明造模成功。與模型對(duì)照組相比,低、高劑量組的小腸推進(jìn)率分別提高83%(p<0.01)和98%(p<0.01)。結(jié)果提示:低、高劑量低聚異麥芽糖具有極顯著改善小鼠小腸推進(jìn)率的功能。說明低聚異麥芽糖在促進(jìn)腸道活動(dòng)方面發(fā)揮積極作用。

表7 低聚異麥芽糖對(duì)小鼠小腸推進(jìn)率的影響Table 7 Effects of isomaltooligosaccharide on intestinal propulsion in

2.5 對(duì)小鼠排便功能的影響

由表8可知,在連續(xù)給予受試物21 d之后,與陰性對(duì)照組比較,模型對(duì)照組的首次排黑便時(shí)間增加186.7%(p<0.01),6 h內(nèi)排黑便重量減少76.2%(p<0.01),說明造模成功。與模型對(duì)照組相比,低、高兩個(gè)劑量組首次排黑便時(shí)間分別降低83%(p<0.01)和86%(p<0.01);6 h內(nèi)排黑便重量分別提高79.4%(p<0.05)和126%(p<0.01),結(jié)果提示:低、高劑量的低聚異麥芽糖具有明顯改善便秘小鼠通便的功能,可有效緩解便秘,有通便的作用。

表8 低聚異麥芽糖對(duì)小鼠排首粒黑便時(shí)間,黑便重量的影響Table 8 Effects of isomaltooligosaccharide on the time of head and stool,the weight of feces in

3 結(jié)論

本文結(jié)果提示,低聚異麥芽糖可以有效增加小鼠腸道內(nèi)雙歧枝菌與乳桿菌的數(shù)量,改善腸道菌群結(jié)構(gòu),治療便秘,無論體外還是在體內(nèi)腸道環(huán)境中都有利于益生菌的生長(zhǎng)。體外結(jié)果顯示低聚異麥芽糖的作用可能呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。

4 討論

目前,低聚異麥芽糖的需求逐漸增大,多年來,對(duì)其功能特性和生產(chǎn)方法[15-16]的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)[17]。低聚異麥芽糖由于其自身良好的物理和生物特性,在食品中可發(fā)揮良好的應(yīng)用[18]。目前低聚異麥芽糖已被應(yīng)用在飼料中[19-20],在保健品、飲料、乳制品、糖果、餅干小食品及焙烤食品中也逐漸得到了應(yīng)用,同時(shí)也作為新資源食品開始應(yīng)用[21]。本文研究提示低聚異麥芽糖在改善腸道菌群結(jié)構(gòu),治療便秘等方面有非常積極的影響。低聚異麥芽糖作為保健品、食品、飼料添加劑以及在醫(yī)藥方面將有良好的應(yīng)用前景,低聚異麥芽糖是一種非常有研究?jī)r(jià)值和發(fā)展?jié)撃艿囊嫔?。本?shí)驗(yàn)的不足之處是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)只設(shè)置了低、高兩個(gè)劑量組,差異不顯著,可設(shè)置多個(gè)劑量組進(jìn)行進(jìn)一步的低聚異麥芽糖含量對(duì)腸道菌群作用的研究。

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