江炎章

地中海貧血是我國南方地區(qū)較為常見的遺傳性溶血性疾病，與遺傳相關(guān)的珠蛋白基因突變、基因缺失等是引起此病的主要危險因素，此病患者一般會有珠蛋白鏈合成異常[1]。根據(jù)血紅蛋白合成障礙的珠蛋白類型，地中海貧血常見的類型主要是α-地中海貧血和β-地中海貧血。由于嚴重類型(包括重型和中間型) α或β地中海貧血均為致死性或致殘性血液病，目前尚無理想的治愈方法，故在目前，通過大規(guī)模人群的遺傳篩查、遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷，避免受累胎兒的出生是最佳選擇[2],也是目前控制地中海貧血發(fā)生最為有效的措施[3-4]。為了解云浮地區(qū)女性和兒童人群地中海貧血基因分型的情況，并探討地中海貧血基因檢測在婚檢、產(chǎn)檢中的重要性，筆者選取2016年10月—2017年9月在我院進行地中海貧血基因檢查，并確診為地中海貧血的女性和兒童的地中海貧血基因分型情況進行分析，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2016 年 10 月— 2017 年 9 月來我院體檢，經(jīng)地中海貧血基因確診為地中海貧血的女性和兒童。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

使用亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司生產(chǎn)的地中海貧血基因檢測試劑盒(PCR-反向點雜交法)。

1.2.2 儀器

分子雜交儀:亞能YN-H16，China;PCR儀：BIO-RAD C1000,USA。

1.3 標本采集

抽靜脈血2 mL，用枸櫞酸鈉或 EDTA抗凝。

1.4 檢測方法

1.4.1 樣本DNA提取

①1.5 mL離心管中加入500 μL細胞裂解液LB；②加入100 μL抗凝全血樣品，劇烈渦旋10～20 s；③加入100 ul沉淀液PB，劇烈渦旋10～20 s；④12 000 r/min離心5 min；⑤小心轉(zhuǎn)移上清液至套進2 mL收集管的DNA結(jié)合柱的凹縫下方，12 000 r/min離心30 s；⑥小心取下收集管，棄濾液。結(jié)合柱重新套進2 mL收集管，加500 μL洗滌液W1至DNA結(jié)合柱的凹縫下方，12 000 r/min離心30 s；⑦小心取下收集管，棄濾液。結(jié)合柱重新套進2 mL收集管，加500 μL洗滌液W2至DNA結(jié)合柱的凹縫下方，12 000 r/min離心30 s；⑧重復(fù)上一步驟一次；⑨小心取下收集管，棄濾液。結(jié)合柱重新套進2 mL收集管， 12 000 r/min離心2 min；⑩小心取出結(jié)合柱，套進1.5 mL干凈離心管中，加100 μL洗脫液EB(10 mM Tris-HCL,pH 8.5)至膜中心，室溫放置1 min，12 000 r/min離心1 min；小心取出結(jié)合柱，1.5 mL離心管底部即是DNA溶液。

1.4.2 模板加樣

①從冰箱中取出PCR反應(yīng)液Ⅰ、Ⅱ和陰、陽性對照各一份，平衡至室溫。②PCR反應(yīng)液Ⅰ、Ⅱ低速離心數(shù)秒，在反應(yīng)管上標上與標本DNA相對應(yīng)的編號。③吸取2 μL標本DNA加入相應(yīng)編號的PCR反應(yīng)液Ⅰ、Ⅱ中。吸取2 μL陽性質(zhì)控加入標有陽性對照的PCR反應(yīng)液Ⅰ、Ⅱ中，吸取2 μL陰性質(zhì)控加入標有陰性對照的PCR反應(yīng)液Ⅰ、Ⅱ中，蓋緊管蓋。④PCR反應(yīng)液Ⅰ、Ⅱ低速離心數(shù)秒。

1.4.3 PCR擴增

根據(jù)PCR儀標準操作規(guī)范，按照以下條件進行擴增(升溫速率3.0 ℃/s，降溫速率3.0 ℃/s，程序擴增完后12 ℃保存)。

50 ℃ 15 min

96 ℃ 15 min

97 ℃ 45 s

62 ℃ 50 s

72 ℃ 75 s

97 ℃ 45 s

59 ℃ 50 s

72 ℃ 75 s

72 ℃ 5 min

1.4.4 雜交顯色

①將PCR反應(yīng)液Ⅰ、Ⅱ傳送至產(chǎn)物分析區(qū)，打開雜交儀，預(yù)熱至43 ℃，同時打開電磁爐，開始煮水。檢查A、B液是否為透明液體。如室溫低，雜交液出現(xiàn)結(jié)晶，請溫浴后使用。②拿出膜條袋，記錄膜條袋上批號，取出膜條，在膜條編號區(qū)寫上與PCR反應(yīng)液Ⅰ、Ⅱ相對應(yīng)的編號。③把帶標記的膜條底面對折，縮短長度后按順序分別放入15 mL雜交管中，手持試管架輕微震蕩，使膜條沉到底部，然后加入6 mL A液，確保A液液面沒過膜條。④把對應(yīng)編號的PCR擴增產(chǎn)物依次全部加入到15 mL雜交管中，加入時應(yīng)把槍頭伸至A液液面之下，且槍頭盡量遠離膜條。為降低產(chǎn)物污染可能性，加PCR產(chǎn)物后應(yīng)避免反復(fù)吹吸。⑤把雜交管管蓋擰緊，將離心管放入沸水浴中煮沸10 min，且確保A液液面完全位于沸水液面之下。⑥沸水浴后，帶上棉手套,取出雜交管，擰緊管蓋，最好每四個或六個一扎，首尾相接，用橡皮筋扎實，放入43 ℃雜交儀中，注意對稱平衡。雜交時間不少于1.5 h，最長不超過4 h。⑦取50 mL離心管，倒入50 mL B液，擰緊管蓋后放入43 ℃雜交儀中預(yù)熱至43 ℃。⑧雜交完成后，先取出15 mL雜交管擰開，然后再取出少量(1～2個)50 mL離心管，用鑷子把雜交管中的膜條快速轉(zhuǎn)入裝有預(yù)熱好B液的50 mL離心管中，擰緊管蓋后輕輕晃動管子把重疊的膜條拉開，將50 mL離心管置于雜交儀中，等全部放進去后，洗滌15 min。注意，先將15 mL雜交管擰開，再將50 mL離心管拿出，此過程應(yīng)快速完成，防止B液溫度下降。⑨配制孵育液(需新鮮配置)。配方：A液∶POD=2000∶1。膜條張數(shù)≤10時，20 mL A液加10 μL POD配成20 mL孵育液；膜條張數(shù)>10時，按1張膜條1 μL POD的比例配制孵育液。⑩洗膜完畢后，用鑷子夾取膜條至已配制好的孵育液中，室溫輕搖孵育至少30 min，孵育時應(yīng)注意使膜條字面朝下并盡量散開，避免完全重疊影響效果。孵育完畢，棄去孵育液。用A液室溫輕搖洗滌兩次，每次5 min。接著用C液室溫洗滌1～2 min，同時配制顯色液洗完后，棄去A液，倒入C液浸沒膜條，室溫輕搖洗滌1～2 min，同時配制顯色液，按順序加入19 mL C液、1 mL TMB、2 μL 30% H2O2，配成一份顯色液，混勻，避光。C液洗滌完后，夾取膜條浸泡于顯色液中，避光顯色5～15 min，5 min時觀察顯色情況，如已顯色可判斷結(jié)果，即可終止，最好不要超過15 min，顯色時應(yīng)注意使膜條字面朝下并盡量散開，避免完全重疊影響效果。顯色完成后，夾取膜條至純凈水中終止顯色。

1.4.5 結(jié)果判定

2 結(jié)果

選取2016年10月—2017年9月期間在我院進行地中海貧血基因檢查，并確診為地中海貧血的女性144例和兒童98例進行基因型分析。

144例地中海貧血女性：其中α-地中海貧血基因 89 例，占陽性率的61.8%，缺失類型主要以αα/-SEA(-SEA 缺失雜合子)為主，β-地中海貧血基因突變 55 例，占陽性率的 38.2%，主要以 CD41-42 位點的單突變雜合子為主，具體見表1。

98例地中海貧血兒童： 其中α-地中海貧血 70 例,占陽性率的71.4%，主要以αα/-SEA(-SEA缺失雜合子)基因型為主。β-地中海貧血基因突變 28 例，占陽性率的 28.6%，主要以654M/N基因型為主，具體見表2。

表1 144例女性地中海貧血患者基因型分型情況

表2 98例兒童地中海貧血患者基因型分型情況

3 討論

地中海貧血在我國南方是一種常見的遺傳性疾病，以兩廣地區(qū)高發(fā)，其中廣東地中海貧血基因攜帶率為11.07%[5]，廣西地中海貧血基因攜帶率為25.30%[6]。云浮處于兩廣交界，是地中海貧血的高發(fā)地區(qū)，地中海貧血防控不可輕視。臨床上根據(jù)其基因型將α地中海貧血分為靜止型、標準型、中間型和重型。靜止型或標準型α地中海貧血是4個α基因僅缺失1個，表現(xiàn)為靜止型；如果缺失2個則為標準型。中間型α地中海貧血即血紅蛋白H病，是4個α基因缺失3個。重型α地中海貧血即血紅蛋白Bart胎兒水腫綜合癥，是由于父母雙方均為α地中海貧血，胎兒4個α基因全部缺失，也是α地中海貧血中最嚴重的類型，胎兒多在妊娠30～40周于宮內(nèi)死亡或產(chǎn)后數(shù)小時死亡。β地中海貧血的發(fā)生主要是該基因的點突變，少數(shù)由于基因缺失引起?；虻狞c突變或某些基因缺失可致β肽鏈的生成完全受抑制，稱為β0地中海貧血；有些點突變使β肽鏈的生成部分受抑制，則稱為β+地中海貧血。同源染色體上的 2 個等位基因突變類型相同者稱為純合子；2 個等位基因中只有一個突變點稱為雜合子；2 個等位基因突變類型不同者稱為雙重雜合子。臨床上可分為輕型、中間型和重型，輕型β地中海貧血是β0或β+地中海貧血的雜合子狀態(tài)；中間型β地中海貧血是一些β+地中海貧血的雙重雜合子和某些地中海貧血的變異型的純合子，或兩種不同變異型珠蛋白生成障礙性貧血的雙重雜合子狀態(tài)；重型β地中海貧血是β0或β+地中海貧血的純合子或β0與β+地中海貧血雙重雜合子[7]。

本研究結(jié)果顯示，云浮地區(qū)女性和兒童地中海貧血主要以α-地中海貧血為主，其中以αα/-SEA(-SEA 缺失雜合子)基因型為主，與國內(nèi)其他地區(qū)的α-地中海貧血基因型類似[8-10]。本地區(qū)女性β-地中海貧血以41-42M/N基因型為主，其次為 654M/N基因型；兒童β-地中海貧血以654M/N基因型為主， 其次為41-42M/N基因型。由此可見本地區(qū)女性與兒童攜帶的主要地中海貧血基因型是基本相同的，地中海貧血防控任務(wù)還很重，做好地中海貧血知識的宣傳和教育，提高人們對地中海貧血的認識，加強婚、孕檢人群的地中海貧血基因檢測是減少和防止重型地中海貧血患兒出生的有效措施。特別是夫婦雙方如果一方已經(jīng)確診是地中海貧血患者，另一方一定也要做地中海貧血基因檢查，排除地中海貧血；如果夫妻雙方攜帶的地中海貧血基因型相同，也要做好遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷，這樣可以更好地避免或減少重型地中海貧血兒的出生，從而減輕社會和家庭的負擔，實現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育。

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