江炎章

地中海貧血是我國南方地區(qū)較為常見的遺傳性溶血性疾病，與遺傳相關(guān)的珠蛋白基因突變、基因缺失等是引起此病的主要危險(xiǎn)因素，此病患者一般會(huì)有珠蛋白鏈合成異常[1]。根據(jù)血紅蛋白合成障礙的珠蛋白類型，地中海貧血常見的類型主要是α-地中海貧血和β-地中海貧血。由于嚴(yán)重類型(包括重型和中間型) α或β地中海貧血均為致死性或致殘性血液病，目前尚無理想的治愈方法，故在目前，通過大規(guī)模人群的遺傳篩查、遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷，避免受累胎兒的出生是最佳選擇[2],也是目前控制地中海貧血發(fā)生最為有效的措施[3-4]。為了解云浮地區(qū)女性和兒童人群地中海貧血基因分型的情況，并探討地中海貧血基因檢測(cè)在婚檢、產(chǎn)檢中的重要性，筆者選取2016年10月—2017年9月在我院進(jìn)行地中海貧血基因檢查，并確診為地中海貧血的女性和兒童的地中海貧血基因分型情況進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2016 年 10 月— 2017 年 9 月來我院體檢，經(jīng)地中海貧血基因確診為地中海貧血的女性和兒童。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

使用亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司生產(chǎn)的地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒(PCR-反向點(diǎn)雜交法)。

1.2.2 儀器

分子雜交儀:亞能YN-H16，China;PCR儀：BIO-RAD C1000,USA。

1.3 標(biāo)本采集

抽靜脈血2 mL，用枸櫞酸鈉或 EDTA抗凝。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 樣本DNA提取

①1.5 mL離心管中加入500 μL細(xì)胞裂解液LB；②加入100 μL抗凝全血樣品，劇烈渦旋10～20 s；③加入100 ul沉淀液PB，劇烈渦旋10～20 s；④12 000 r/min離心5 min；⑤小心轉(zhuǎn)移上清液至套進(jìn)2 mL收集管的DNA結(jié)合柱的凹縫下方，12 000 r/min離心30 s；⑥小心取下收集管，棄濾液。結(jié)合柱重新套進(jìn)2 mL收集管，加500 μL洗滌液W1至DNA結(jié)合柱的凹縫下方，12 000 r/min離心30 s；⑦小心取下收集管，棄濾液。結(jié)合柱重新套進(jìn)2 mL收集管，加500 μL洗滌液W2至DNA結(jié)合柱的凹縫下方，12 000 r/min離心30 s；⑧重復(fù)上一步驟一次；⑨小心取下收集管，棄濾液。結(jié)合柱重新套進(jìn)2 mL收集管， 12 000 r/min離心2 min；⑩小心取出結(jié)合柱，套進(jìn)1.5 mL干凈離心管中，加100 μL洗脫液EB(10 mM Tris-HCL,pH 8.5)至膜中心，室溫放置1 min，12 000 r/min離心1 min；小心取出結(jié)合柱，1.5 mL離心管底部即是DNA溶液。

1.4.2 模板加樣

①從冰箱中取出PCR反應(yīng)液Ⅰ、Ⅱ和陰、陽性對(duì)照各一份，平衡至室溫。②PCR反應(yīng)液Ⅰ、Ⅱ低速離心數(shù)秒，在反應(yīng)管上標(biāo)上與標(biāo)本DNA相對(duì)應(yīng)的編號(hào)。③吸取2 μL標(biāo)本DNA加入相應(yīng)編號(hào)的PCR反應(yīng)液Ⅰ、Ⅱ中。吸取2 μL陽性質(zhì)控加入標(biāo)有陽性對(duì)照的PCR反應(yīng)液Ⅰ、Ⅱ中，吸取2 μL陰性質(zhì)控加入標(biāo)有陰性對(duì)照的PCR反應(yīng)液Ⅰ、Ⅱ中，蓋緊管蓋。④PCR反應(yīng)液Ⅰ、Ⅱ低速離心數(shù)秒。

1.4.3 PCR擴(kuò)增

根據(jù)PCR儀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范，按照以下條件進(jìn)行擴(kuò)增(升溫速率3.0 ℃/s，降溫速率3.0 ℃/s，程序擴(kuò)增完后12 ℃保存)。

50 ℃ 15 min

96 ℃ 15 min

97 ℃ 45 s

62 ℃ 50 s

72 ℃ 75 s

97 ℃ 45 s

59 ℃ 50 s

72 ℃ 75 s

72 ℃ 5 min

1.4.4 雜交顯色

①將PCR反應(yīng)液Ⅰ、Ⅱ傳送至產(chǎn)物分析區(qū)，打開雜交儀，預(yù)熱至43 ℃，同時(shí)打開電磁爐，開始煮水。檢查A、B液是否為透明液體。如室溫低，雜交液出現(xiàn)結(jié)晶，請(qǐng)溫浴后使用。②拿出膜條袋，記錄膜條袋上批號(hào)，取出膜條，在膜條編號(hào)區(qū)寫上與PCR反應(yīng)液Ⅰ、Ⅱ相對(duì)應(yīng)的編號(hào)。③把帶標(biāo)記的膜條底面對(duì)折，縮短長(zhǎng)度后按順序分別放入15 mL雜交管中，手持試管架輕微震蕩，使膜條沉到底部，然后加入6 mL A液，確保A液液面沒過膜條。④把對(duì)應(yīng)編號(hào)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物依次全部加入到15 mL雜交管中，加入時(shí)應(yīng)把槍頭伸至A液液面之下，且槍頭盡量遠(yuǎn)離膜條。為降低產(chǎn)物污染可能性，加PCR產(chǎn)物后應(yīng)避免反復(fù)吹吸。⑤把雜交管管蓋擰緊，將離心管放入沸水浴中煮沸10 min，且確保A液液面完全位于沸水液面之下。⑥沸水浴后，帶上棉手套,取出雜交管，擰緊管蓋，最好每四個(gè)或六個(gè)一扎，首尾相接，用橡皮筋扎實(shí)，放入43 ℃雜交儀中，注意對(duì)稱平衡。雜交時(shí)間不少于1.5 h，最長(zhǎng)不超過4 h。⑦取50 mL離心管，倒入50 mL B液，擰緊管蓋后放入43 ℃雜交儀中預(yù)熱至43 ℃。⑧雜交完成后，先取出15 mL雜交管擰開，然后再取出少量(1～2個(gè))50 mL離心管，用鑷子把雜交管中的膜條快速轉(zhuǎn)入裝有預(yù)熱好B液的50 mL離心管中，擰緊管蓋后輕輕晃動(dòng)管子把重疊的膜條拉開，將50 mL離心管置于雜交儀中，等全部放進(jìn)去后，洗滌15 min。注意，先將15 mL雜交管擰開，再將50 mL離心管拿出，此過程應(yīng)快速完成，防止B液溫度下降。⑨配制孵育液(需新鮮配置)。配方：A液∶POD=2000∶1。膜條張數(shù)≤10時(shí)，20 mL A液加10 μL POD配成20 mL孵育液；膜條張數(shù)>10時(shí)，按1張膜條1 μL POD的比例配制孵育液。⑩洗膜完畢后，用鑷子夾取膜條至已配制好的孵育液中，室溫輕搖孵育至少30 min，孵育時(shí)應(yīng)注意使膜條字面朝下并盡量散開，避免完全重疊影響效果。孵育完畢，棄去孵育液。用A液室溫輕搖洗滌兩次，每次5 min。接著用C液室溫洗滌1～2 min，同時(shí)配制顯色液洗完后，棄去A液，倒入C液浸沒膜條，室溫輕搖洗滌1～2 min，同時(shí)配制顯色液，按順序加入19 mL C液、1 mL TMB、2 μL 30% H2O2，配成一份顯色液，混勻，避光。C液洗滌完后，夾取膜條浸泡于顯色液中，避光顯色5～15 min，5 min時(shí)觀察顯色情況，如已顯色可判斷結(jié)果，即可終止，最好不要超過15 min，顯色時(shí)應(yīng)注意使膜條字面朝下并盡量散開，避免完全重疊影響效果。顯色完成后，夾取膜條至純凈水中終止顯色。

1.4.5 結(jié)果判定

2 結(jié)果

選取2016年10月—2017年9月期間在我院進(jìn)行地中海貧血基因檢查，并確診為地中海貧血的女性144例和兒童98例進(jìn)行基因型分析。

144例地中海貧血女性：其中α-地中海貧血基因 89 例，占陽性率的61.8%，缺失類型主要以αα/-SEA(-SEA 缺失雜合子)為主，β-地中海貧血基因突變 55 例，占陽性率的 38.2%，主要以 CD41-42 位點(diǎn)的單突變雜合子為主，具體見表1。

98例地中海貧血兒童： 其中α-地中海貧血 70 例,占陽性率的71.4%，主要以αα/-SEA(-SEA缺失雜合子)基因型為主。β-地中海貧血基因突變 28 例，占陽性率的 28.6%，主要以654M/N基因型為主，具體見表2。

表1 144例女性地中海貧血患者基因型分型情況

表2 98例兒童地中海貧血患者基因型分型情況

3 討論

地中海貧血在我國南方是一種常見的遺傳性疾病，以兩廣地區(qū)高發(fā)，其中廣東地中海貧血基因攜帶率為11.07%[5]，廣西地中海貧血基因攜帶率為25.30%[6]。云浮處于兩廣交界，是地中海貧血的高發(fā)地區(qū)，地中海貧血防控不可輕視。臨床上根據(jù)其基因型將α地中海貧血分為靜止型、標(biāo)準(zhǔn)型、中間型和重型。靜止型或標(biāo)準(zhǔn)型α地中海貧血是4個(gè)α基因僅缺失1個(gè)，表現(xiàn)為靜止型；如果缺失2個(gè)則為標(biāo)準(zhǔn)型。中間型α地中海貧血即血紅蛋白H病，是4個(gè)α基因缺失3個(gè)。重型α地中海貧血即血紅蛋白Bart胎兒水腫綜合癥，是由于父母雙方均為α地中海貧血，胎兒4個(gè)α基因全部缺失，也是α地中海貧血中最嚴(yán)重的類型，胎兒多在妊娠30～40周于宮內(nèi)死亡或產(chǎn)后數(shù)小時(shí)死亡。β地中海貧血的發(fā)生主要是該基因的點(diǎn)突變，少數(shù)由于基因缺失引起。基因的點(diǎn)突變或某些基因缺失可致β肽鏈的生成完全受抑制，稱為β0地中海貧血；有些點(diǎn)突變使β肽鏈的生成部分受抑制，則稱為β+地中海貧血。同源染色體上的 2 個(gè)等位基因突變類型相同者稱為純合子；2 個(gè)等位基因中只有一個(gè)突變點(diǎn)稱為雜合子；2 個(gè)等位基因突變類型不同者稱為雙重雜合子。臨床上可分為輕型、中間型和重型，輕型β地中海貧血是β0或β+地中海貧血的雜合子狀態(tài)；中間型β地中海貧血是一些β+地中海貧血的雙重雜合子和某些地中海貧血的變異型的純合子，或兩種不同變異型珠蛋白生成障礙性貧血的雙重雜合子狀態(tài)；重型β地中海貧血是β0或β+地中海貧血的純合子或β0與β+地中海貧血雙重雜合子[7]。

本研究結(jié)果顯示，云浮地區(qū)女性和兒童地中海貧血主要以α-地中海貧血為主，其中以αα/-SEA(-SEA 缺失雜合子)基因型為主，與國內(nèi)其他地區(qū)的α-地中海貧血基因型類似[8-10]。本地區(qū)女性β-地中海貧血以41-42M/N基因型為主，其次為 654M/N基因型；兒童β-地中海貧血以654M/N基因型為主， 其次為41-42M/N基因型。由此可見本地區(qū)女性與兒童攜帶的主要地中海貧血基因型是基本相同的，地中海貧血防控任務(wù)還很重，做好地中海貧血知識(shí)的宣傳和教育，提高人們對(duì)地中海貧血的認(rèn)識(shí)，加強(qiáng)婚、孕檢人群的地中海貧血基因檢測(cè)是減少和防止重型地中海貧血患兒出生的有效措施。特別是夫婦雙方如果一方已經(jīng)確診是地中海貧血患者，另一方一定也要做地中海貧血基因檢查，排除地中海貧血；如果夫妻雙方攜帶的地中海貧血基因型相同，也要做好遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷，這樣可以更好地避免或減少重型地中海貧血兒的出生，從而減輕社會(huì)和家庭的負(fù)擔(dān)，實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育。

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