李 碩

（上海食品科技學(xué)校，上海201599）

藍(lán)莓(Blueberry)屬越桔科越桔屬(Vacinium)灌木,原產(chǎn)北美[1]。近20年，在美國(guó)、加拿大、日本和歐洲的很多國(guó)家藍(lán)莓都倍受人們青睞。近年來(lái)，我國(guó)開始種植藍(lán)莓，并對(duì)藍(lán)莓開展研究。近年美國(guó)農(nóng)業(yè)部(USDA)和美國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)研究院(NIH)著重對(duì)藍(lán)莓的營(yíng)養(yǎng)與保健作用進(jìn)行了深入研究，結(jié)果表明，藍(lán)莓富含抗氧化劑、細(xì)菌生長(zhǎng)抑制劑、葉酸、花色素苷、類黃酮等化合物，而這些化合物對(duì)于人體內(nèi)自由基的清除、抑制及逆轉(zhuǎn)人體衰老有密切關(guān)系[2-3]。隨著人們對(duì)健康生活的需求越來(lái)越高，富含多酚類等抗氧化物質(zhì)成分的藍(lán)莓成為保健品市場(chǎng)的新寵，藍(lán)莓的生產(chǎn)和深加工引起了生產(chǎn)者和消費(fèi)者的廣泛關(guān)注[4]。

在眾多的藍(lán)莓加工產(chǎn)品中，藍(lán)莓酒既保留藍(lán)莓果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，提高附加值，又作為時(shí)尚飲品滿足市場(chǎng)的需要。藍(lán)莓酒發(fā)酵后具有抗氧化能力，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，將逐漸成為藍(lán)莓深加工中的主導(dǎo)產(chǎn)品[5]。Rupasinghe等[6]研究顯示，藍(lán)莓酒的總抗氧化能力和總酚含量具有較高水平，酚類物質(zhì)中的黃酮和酚酸類能夠清除人體自由基，賦予了藍(lán)莓酒較強(qiáng)的抗氧化能力。隨著藍(lán)莓酒抗氧化性的深入研究，引起了生產(chǎn)者和消費(fèi)者的廣泛關(guān)注，研究不同品種藍(lán)莓酒中酚類物質(zhì)及其抗氧化活性對(duì)藍(lán)莓酒的實(shí)際生產(chǎn)有著積極的推動(dòng)作用。因此本文對(duì)上海市金山地區(qū)種植的6種藍(lán)莓進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)生產(chǎn)的藍(lán)莓酒的抗氧化能力及其總酚、總黃酮等抗氧化物質(zhì)含量進(jìn)行了檢測(cè)分析，科學(xué)評(píng)價(jià)藍(lán)莓酒的抗氧化活性，為深入開發(fā)利用藍(lán)莓酒資源提供理論依據(jù)，為金山地區(qū)的果酒發(fā)展提供借鑒。

表1 藍(lán)莓品種

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

藍(lán)莓由上海市藍(lán)莓研究所提供，見表1。

抗氧化能力（T-AOC）測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所。其他試劑均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)莓酒釀造工藝

鮮果清洗?榨汁?酶解?調(diào)整?接種活化好的酵母液?主發(fā)酵（23℃）?后發(fā)酵?陳釀?澄清?過(guò)濾?殺菌?灌裝?成品

操作要點(diǎn)：調(diào)整初始糖度至180 g/L；接種量按照果醪量的0.151‰加入活性干酵母，用藍(lán)莓醪液活化，活化條件為30℃下3 h；發(fā)酵至殘?zhí)遣辉倜黠@降低時(shí)去除酒腳，下罐。

1.2.2 總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)定試劑盒法

定義：在37℃時(shí)，每分鐘每毫升酒樣使反應(yīng)體系的吸光度（OD）值每增加0.01時(shí)，為一個(gè)總抗氧化能力單位。

計(jì)算公式：

其中：30為37℃反應(yīng)30 min，0.1為取樣0.1 mL。1.2.3 總酚測(cè)試

總酚測(cè)試采用福林酚法[7]，以對(duì)羥基苯甲酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y=0.0672+0.0011x，r2=0.9804。

1.2.4 總黃酮測(cè)試

總黃酮測(cè)試，以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用硝酸-亞硝酸鈉比色法[8]，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y=0.03986+5.7910×10-4x，r2=0.9983。

1.2.5 總?cè)圃碥諟y(cè)試

準(zhǔn)確稱取20.0 mg熊果酸，加入95%vol乙醇溶解并定容至100 mL，配成標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL和3.00 mL于10 mL比色管中，氮吹干。各加入5%的香草醛-冰醋酸溶液0.5 mL，搖勻，再各加高氯酸1.0 mL，搖勻，60℃水浴15 min，取出冷卻，加入冰醋酸5.0 mL，搖勻，于548 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以熊果酸濃度（或質(zhì)量）為橫坐標(biāo)（x），吸光度作為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各取一定體積的待測(cè)樣品上清液，按上述方法操作。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.04957+5.61145×10-4x，r2=0.9923。

1.2.6 清除DPPH能力測(cè)定

參照Brand-William等建立的方法[9]，準(zhǔn)確配制濃度為1×10-4mol/L的溶液。移取上述樣品提取液0.2 mL，DPPH溶液3.8 mL，以0.2 mL 50%vol乙醇與DPPH反應(yīng)液為空白。避光反應(yīng)1 h，517 nm測(cè)定吸光度。

因此，各酒樣的清除率（%）=（1-A1/A0）×100%。

其中：A1為測(cè)試液吸光度，A0為空白對(duì)照組的吸光度。

1.2.7 清除ABTS·+能力測(cè)定

將7 mmol/L的ABTS溶液和140 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液，以500∶88比例混合，避光靜止12～16 h，形成墨綠色穩(wěn)定化合物，作為儲(chǔ)備液。將儲(chǔ)備液用乙醇稀釋至734 nm吸光度0.70±0.02。移取上述提取液0.1 mL，加入3.9 mL ABTS·+工作液3.9 mL，混勻后，靜止避光反應(yīng)6 min，測(cè)試734 nm波長(zhǎng)吸光度。以0.1 mL 50%vol乙醇和3.9 mLABTS·+工作液吸光度為空白對(duì)照A0。

得到各樣品的ABTS·+清除率（%）=（1-A1/A0）×100%。

1.2.8 亞鐵離子還原能力測(cè)定（FRAP）[10-11]

以10∶1∶1混合0.3 mol/L(pH 3.6)的醋酸緩沖溶液，10 mmol/L TPTZ溶液和20 mmol/L氯化鐵溶液。

準(zhǔn)確吸取0.1mL系列濃度為0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L和1 mmol/L的硫酸亞鐵溶液，與0.3 mL去離子水混合，再加入3.9 mL FRAP溶液，混勻，37℃反應(yīng)4 min。593 nm測(cè)吸光度，繪制硫酸亞鐵-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0618+0.000288x，r2=0.9926。

準(zhǔn)確吸取0.1 mL上述樣品提取液，與0.3 mL去離子水混合，再加入3.9 mL FRAP溶液，混勻，37℃反應(yīng)4 min，593 nm測(cè)吸光度。以硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)的FeSO4濃度，定義為當(dāng)量濃度（FRAP值）。最終結(jié)果表示為每FRAP值越大，表示抗氧化活性越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓酒總抗氧化能力的比較

總抗氧化能力實(shí)際上是測(cè)定鐵離子的還原能力，即將體系中的Fe3+還原成Fe2+，后者可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物，通過(guò)分光光度計(jì)比色測(cè)出其抗氧化能力的高低，光吸收值變化越大，總抗氧化能力越強(qiáng)。測(cè)試結(jié)果見表2。

表2 總抗氧化指標(biāo)測(cè)試結(jié)果

從表2可看出，巴爾德溫和梯芙蘭品種的藍(lán)莓酒總抗氧化能力明顯高于其他品種。

2.2 藍(lán)莓酒總酚含量的比較（圖1）

近年來(lái)很多實(shí)驗(yàn)都證實(shí)紅葡萄酒具有抗氧化性，而其抗氧化性主要來(lái)源于其自身所含的酚類物質(zhì)，總酚含量越高，抗氧化性則越強(qiáng)[12]。酚類物質(zhì)是強(qiáng)體外抗氧化劑，許多研究證實(shí)其有預(yù)防心血管疾病、預(yù)防癌癥等功能，酚類物質(zhì)的這些功能和其清除自由基金屬螯合能力等有直接的關(guān)系[13]。

圖1 6種品種藍(lán)莓酒總酚含量

圖1表明，6種品種藍(lán)莓酒均具有一定量的總酚，其中巴爾德溫和梯芙蘭藍(lán)莓酒含量較高，分別為1.234 mg/mL±0.026 mg/mL和1.160 mg/mL±0.022 mg/mL，喜來(lái)藍(lán)莓酒含量最少，為0.406 mg/mL±0.004 mg/mL。對(duì)應(yīng)的紅酒、白葡萄酒、黃酒，其酚類物質(zhì)的含量分別是1～4 mg/mL、0.2～0.4 mg/mL、0.249 g/mL[14]。藍(lán)莓酒總酚含量接近于紅葡萄酒，高于白葡萄酒和黃酒。

2.3 藍(lán)莓酒總黃酮含量的比較（圖2）

黃酮類化合物是多酚的主要成分之一，具有清除氧自由基等多種生理活性，在抗氧化、保護(hù)視力、延緩衰老、增強(qiáng)免疫力、保護(hù)人體免受自由基的損傷等方面起到很好的作用[15]。

圖2 6種品種藍(lán)莓酒總黃酮含量

如圖2所示，6種品種藍(lán)莓酒均具有一定量的總黃酮，其中巴爾德溫藍(lán)莓酒含量最高，含量為1.232 mg/mL±0.025 mg/mL，其次是梯芙蘭藍(lán)莓酒，含量為1.010 mg/mL±0.021 mg/mL，喜來(lái)藍(lán)莓酒含量最少，為0.216 mg/mL±0.001 mg/mL。

大量實(shí)驗(yàn)表明，一些類黃酮物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化性，能抗微生物、螯合金屬離子、抑制低密度脂蛋白氧化和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等作用。因此，食物類黃酮物質(zhì)生物學(xué)作用及其機(jī)制已成為當(dāng)今營(yíng)養(yǎng)與食品科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[16]。因此，研究藍(lán)莓酒中總黃酮的含量，對(duì)藍(lán)莓酒的開發(fā)具有指導(dǎo)意義。

2.4 藍(lán)莓酒總?cè)圃碥蘸康谋容^

三萜皂苷廣泛分布于多種植物的根、莖、葉、樹皮及花中，資源豐富，具有抗腫瘤、抗衰老及增強(qiáng)免疫力等生理活性，可預(yù)防和治療多種疾病,對(duì)開發(fā)利用天然資源具有廣闊的發(fā)展前景[17]。本實(shí)驗(yàn)采用比色法測(cè)定6種品種藍(lán)莓酒總?cè)圃碥蘸浚▓D3）。

圖3 6種品種藍(lán)莓酒總?cè)圃碥蘸?/p>

如圖3所示，6種品種藍(lán)莓酒總?cè)圃碥蘸孔畹?.618mg/mL±0.011mg/mL，最高15.229mg/mL±1.003 mg/mL，表明藍(lán)莓酒含有一定量總?cè)圃碥眨哂锌顾ダ?、增?qiáng)免疫力等功能。奧尼爾品種藍(lán)莓酒具有較高的總?cè)圃碥蘸俊?/p>

2.5 藍(lán)莓酒清除DPPH自由基能力的比較

DPPH自由基在517 nm處有最大吸光值，它能夠從釋放質(zhì)子的物質(zhì)處得到質(zhì)子，形成一種穩(wěn)定的反磁性分子[18]。研究表明[19]，釋放質(zhì)子是物質(zhì)抗氧化能力的機(jī)理之一，通過(guò)測(cè)定物質(zhì)對(duì)自由基的清除能力，可以較迅速地評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化能力。所以，在517 nm處吸光值會(huì)變小，原先穩(wěn)定的紫色會(huì)變淺或成為黃色。吸光值越低表示清除自由基的能力越強(qiáng)。結(jié)果見圖4。

圖4 6種品種藍(lán)莓酒清除DPPH自由基的能力

如圖4所示，6種品種藍(lán)莓酒對(duì)自由基的清除能力最低為36.78%±3.04%，最高為74.02%±4.87%，這表明藍(lán)莓酒有明顯的清除自由基的能力。巴爾德溫和梯芙蘭藍(lán)莓酒具有較強(qiáng)的清除自由基能力。在體內(nèi)，若自由基的形成超過(guò)人體機(jī)能自身保護(hù)能力時(shí)，就會(huì)誘發(fā)如動(dòng)脈粥狀硬化等慢性病。藍(lán)莓酒作為一種自由基抑制劑，可以降低自由基在人體中產(chǎn)生的危害。

2.6 藍(lán)莓酒清除ABTS·+能力的比較（圖5）

1993年，Miller等[20]首次介紹了用ABTS·+法來(lái)測(cè)定一些化合物的抗氧化活性。在734 nm處，ABTS·+有特征吸收，利用待測(cè)化合物清除ABTS·+引起吸光度變化來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化活性[21]。此后，在飲料、一些植物提取物，尤其是葡萄酒中廣泛采用ABTS·+法來(lái)判斷其抗氧化活性[22-23]。

圖5 6種品種藍(lán)莓酒清除ABTS·+的能力

如圖5所示，6種品種藍(lán)莓酒對(duì)ABTS·+的清除能力最低為45.78%±3.28%，最高為83.91%±5.51%，這表明藍(lán)莓酒有明顯的清除ABTS·+能力。巴爾德溫和梯芙蘭藍(lán)莓酒具有較強(qiáng)的清除ABTS·+能力。

2.7 藍(lán)莓酒亞鐵離子還原能力的比較

測(cè)定藍(lán)莓酒還原力，實(shí)質(zhì)上是檢驗(yàn)藍(lán)莓酒中是否含有良好的電子供應(yīng)體，通過(guò)自身的還原作用給出電子而清除自由基的。還原力越強(qiáng)，則抗氧化性越強(qiáng)。因此可通過(guò)測(cè)定還原力來(lái)說(shuō)明抗氧化活性的強(qiáng)弱。本試驗(yàn)吸光度越大，F(xiàn)RAP值越大，還原力越強(qiáng)，表示抗氧化活性越強(qiáng)。結(jié)果見圖6。

圖6 6種品種藍(lán)莓酒的亞鐵離子還原能力

如圖6所示，亞鐵離子還原能力：巴爾德溫＞梯芙蘭＞藍(lán)豐＞佐治亞＞奧尼爾＞喜來(lái)。其中，巴爾德溫品種的藍(lán)莓酒亞鐵離子還原能力為30.72 mmol±2.38 mmol Fe2SO4L/mL酒樣。

3 總結(jié)

3.1 建立了一個(gè)以總抗氧化能力、清除DPPH自由基能力、清除ABTS·+能力、離子還原能力為指標(biāo)的抗氧化檢測(cè)體系。根據(jù)此體系，對(duì)不同品種藍(lán)莓采用相同工藝釀造的藍(lán)莓酒的抗氧化能力進(jìn)行了初步檢測(cè)。

3.2 藍(lán)莓酒具有一定的抗氧化能力，不同品種藍(lán)莓酒差異較大，其中巴爾德溫和梯芙蘭品種抗氧化能力最強(qiáng)。

3.3 藍(lán)莓酒總酚含量：巴德爾溫＞梯芙蘭＞奧尼爾＞藍(lán)豐、佐治亞＞喜來(lái)，其總酚含量范圍為0.406～1.234 mg/mL，接近于紅葡萄酒，高于白葡萄酒和黃酒。

3.4 藍(lán)莓酒總黃酮含量：巴德爾溫＞梯芙蘭＞藍(lán)豐＞佐治亞＞奧尼爾＞喜來(lái)，其總黃酮含量范圍為0.216～1.232 mg/mL，接近于紅葡萄酒，高于白葡萄酒和黃酒。

3.5 藍(lán)莓酒的總酚、總黃酮對(duì)其抗氧化能力有正相關(guān)性，也進(jìn)一步說(shuō)明藍(lán)莓酒中的多酚物質(zhì)是藍(lán)莓酒抗氧化作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.6 藍(lán)莓酒含有一定量總?cè)圃碥?，具有抗衰老、增?qiáng)免疫力功能。其中奧尼爾品種含量最高，為15.229 mg/mL。

參考文獻(xiàn)：

[1]PRITTS M,HANCOCK J.Highbush Blueberry Production Guide[M].Northeast Regional Agricultural Engineering Service,1992：4-7.

[2]JOSEPH J A,SHUKITT-HALE B,DENISOVA N A,et al.Reversals of age-related declines in the neuronal signal transduction,cognitive,and motor behavioral deficits with blueberry,spinach,or strawberry dietary supplementation[J].Journal of neuroscience,1999,19(18)：8114-8121.

[3]苑兆和.世界藍(lán)莓生產(chǎn)歷史與發(fā)展趨勢(shì)[J].落葉果樹,2003(1)：49-52.

[4]ZAFRA-STONE S,YASMIN T,BAGCHI M,et al.Berry anthocyanins as novel antioxidants in human health and disease prevention[J].Mol nutr food res,2007,51(6)：675-683.

[5]梁晨,張倩雯,盛啟明,等.不同品種藍(lán)莓酒抗氧化能力及其多酚含量分析[J].中國(guó)釀造,2013(8)：46-49.

[6]RUPASINGHE H P V,CLEGG S.Total antioxidant capacity,total phenolic content,mineral elements,and histamine concentrations in wines of different fruit sources[J].Journal of food composition and analysis,2007,20(2)：133-137.

[7]SLINKARD K,SINGLETON V L.Total phenol analyses：automation and comparison with manual methods[J].American journal of enology and viticulture,1977,28：40-55.

[8]朱友春,田世龍,王東暉.比色法測(cè)定苦蕎中黃酮含量的方法改進(jìn)[J].甘肅科技,2003(2)：13-14.

[9]BRAND-WILLIAM W,CUVELIER M E,BERSET C.Use of a free radical methods to evaluate antioxidant activity[J].LWT-Food science and Technology,1995,28：25-30.

[10]SHON M Y,LEE J,CHOI J H,et al.Antioxidant and free radical scavenging activity of methanol extract of chungkukjang[J].Journal of Food composition and analysis,2007,20(2)：113-118.

[11]PRIOR R L,WU X,SCHAICH K.Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements[J].Journal of agricultural and food chemistry,2005,53(10)：4290-4302.

[12]胡博然,聞雯,陰淑貞,等.電子順磁共振波譜儀分析干紅葡萄酒DPPH清除能力及其與總酚含量的關(guān)系[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,45(1)：135-141.

[13]LODOVICI M,GUGLIELMI F,CASALINI M,et al.Antioxidant and radical scavenging properties in vitro of polyphenolic extracts from red wine[J].European journal of nutrition,2001,40：74-77.

[14]鄭校先,李燕,徐維菲,等.黃酒的抗氧化活性研究[J].釀酒科技,2009(10)：57-64.

[15]黃曉杰,柴哲,楊鐘燕,等.藍(lán)莓酒發(fā)酵過(guò)程中抗氧化物質(zhì)變化規(guī)律研究[J].食品工業(yè)科技,2013(17)：103-109.

[16]金紅,段輝,何亞敦,等.保健酒中總黃酮測(cè)定方法的比選[J].釀酒科技,2009(2)：79-81.

[17]陳穎,董孝剛,孟麗,等.天花粉中總?cè)圃碥盏暮糠治鯷J].中國(guó)野生植物資源,2010(8)：61-63.

[18]SOARES J R,DINS T C P,CUNHAA P,et al.Antioxidant activity of some extracts ofThymus zygis[J].Free radical research,1997,26：469-478.

[19]勾明玥,劉梁,張春枝.采用DPPH法測(cè)定26種植物的抗氧化活性[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2016,36(3)：148-150.

[20]MILLER N J,RICE-EVANS C A,DAVIES M J,et al.A novel method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant status in premature neonates[J].Clinical science,1993,84：407-412.

[21]KIRSCHBAUM B.Total urine antioxidant capacity[J].Clinica chimica acta,2001,305：167-173.

[22]MAZZA G,KAY C D,COTTRELL T,et al.Absorption of anthocyanins from blueberries and serum antioxidant status in human subjects[J].Agric food chem,2002,50：7731-7737.

[23]DEBEER D,JOUBERT E,GELDERBLOM W C A,et al.Antioxidant activity of South African red and white cultivar wines：free radical scavenging[J].Agric food chem,2003,51：902-909.