李嶺卓，李 銳，熊小毛，楊團員，張明春，還 萍，馬向東

（1.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源綠色轉(zhuǎn)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430062；2.湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司，湖北 松滋 434200）

在釀酒相關(guān)研究和生產(chǎn)中，常涉及乙醇含量的測定。乙醇含量測定的方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、生物傳感器法[1-2]、密度瓶法、酒精計法、重鉻酸鉀比色法等[3]。這些方法中，密度瓶法、酒精計法需要對樣品進行蒸餾，操作較為繁瑣；液相色譜法需要用示差折光檢測器，一般實驗室不具備，或者需對樣品進行柱前衍生化[4]，操作也較為復(fù)雜；氣相色譜法[5]準(zhǔn)確度高，但存在儀器昂貴、操作復(fù)雜、測定時間長等缺點；生物傳感器法操作方便、測定準(zhǔn)確，不過存在價格較高、設(shè)備不普及等不足。

相比較而言，重鉻酸鉀比色法操作較簡單，能同時測定多個樣品，不需要特殊儀器，一般實驗室均能進行。其原理：在酸性條件下重鉻酸鉀與乙醇反應(yīng)生成三價鉻離子（Cr3+），而Cr3+在590 nm[6]處有吸收峰，可以利用吸光度值計算溶液中的乙醇含量。

在發(fā)酵液中，除乙醇外還含有其他還原性物質(zhì)可以與重鉻酸鉀反應(yīng)[7]，也會生成Cr3+，使得測定結(jié)果偏大。為了排除還原性物質(zhì)的干擾，本研究用煮沸、補水的方式除去發(fā)酵液中的乙醇，將原發(fā)酵液和除去乙醇的發(fā)酵液都與重鉻酸鉀反應(yīng)，得到兩個吸光度，則兩個吸光度之差（前者減去后者）可以表示乙醇的實際含量。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：實驗中用的哈爾濱小麥王啤酒、波爾多騎士紅葡萄酒購于超市；12 h、24 h、48 h的釀酒酵母YPD發(fā)酵液實驗室自備。

乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 g/L）：分析純無水乙醇10 g，蒸餾水定容至1 L。

YPD溶液：酵母粉5 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1 L，108℃滅菌20 min。

重鉻酸鉀溶液：稱取50 g重鉻酸鉀（分析純）溶于500 mL水中，加100 mL濃硫酸，冷卻，蒸餾水定容至1 L。

儀器設(shè)備：SectraMax M2酶標(biāo)儀，Molecular Devices公司；M-100生物傳感器，深圳西爾曼科技有限公司；微波爐；電爐；水浴鍋；電子天平等。

1.2 試驗方法

1.2.1 重鉻酸鉀比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線

取乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水稀釋成乙醇濃度分別為0、0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L的樣品溶液。在15 mm×15 cm的試管中，分別加入5 mL樣品溶液、2 mL蒸餾水和3 mL重鉻酸鉀溶液，加試管塞，沸水浴10 min，流水冷卻至室溫，取200 μL反應(yīng)液至酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀測定其在590 nm處的吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)，乙醇濃度（g/L）為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 煮沸方式與時長的探索

探究微波爐和電爐兩種煮沸方式，1 min、2 min、3 min 3個煮沸時長對乙醇殘留量的影響。

1.2.3 操作過程

操作流程見圖1。發(fā)酵液用蒸餾水稀釋合適的倍數(shù)，使稀釋后乙醇濃度在0.2～1.4 g/L之間，得待測液Ⅰ。取10 mL待測液Ⅰ加入50 mL錐形瓶中，稱重，記錄重量，微波爐或電爐煮沸2 min（沸騰后開始計時），冷卻，將錐形瓶放在天平上，補加蒸餾水至原重量，得待測液Ⅱ。

按5 mL待測液+2 mL蒸餾水+3 mL重鉻酸鉀溶液的體系反應(yīng)，測吸光度（操作參照1.2.1）。將吸光度Ⅰ與吸光度Ⅱ之差帶入線性方程，再乘以稀釋倍數(shù)，即可以計算出發(fā)酵液中的乙醇含量。

圖1 操作流程

1.2.4 煮沸對YPD溶液的影響

取YPD溶液，蒸餾水稀釋15倍，得YPD待測液。取部分YPD待測液煮沸、補水，將煮沸前的YPD待測液和煮沸、補水后的YPD待測液分別與重鉻酸鉀反應(yīng)，測吸光度。

1.2.5 回收率及精密度實驗

取2 g無水乙醇，用YPD溶液定容至100 mL。將該溶液用蒸餾水稀釋15倍，按1.2.3的方法，測定溶液中乙醇的含量，做6個平行。

1.2.6 發(fā)酵液、葡萄酒、啤酒中乙醇濃度的測定

取12 h、24 h、48 h的釀酒酵母YPD發(fā)酵液。發(fā)酵液均稀釋10倍，葡萄酒稀釋100倍，啤酒稀釋25倍。按1.2.3的方法，測定各樣品中乙醇含量，各做3個平行。同時用生物傳感器測定各樣品中乙醇含量，作為參照。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）

圖2 重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖2可看出，乙醇濃度在0.2～1.4 g/L的范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好，線性回歸方程為y=6.8141x+0.0365（R2=0.9993），其中x是吸光度值，y是乙醇濃度。則乙醇濃度計算公式為：乙醇濃度（g/L）=[（吸光度Ⅰ-吸光度Ⅱ）×6.8141+0.0365]×稀釋倍數(shù)。

2.2 煮沸方式及時長的探索結(jié)果

煮沸方式和時長對殘留乙醇濃度的影響見表1。由表1可知，兩種煮沸方式均可。煮沸時長2 min及以上時，發(fā)酵液中的乙醇基本完全揮發(fā)，故選定煮沸時長為2 min。

表1 煮沸方式和時長對殘留乙醇濃度的影響

2.3 煮沸對YPD的影響（表2）

表2 煮沸對YPD溶液的影響

由表2可知，煮沸前的YPD待測液與重鉻酸鉀反應(yīng)所得的吸光度，和煮沸、補水后的YPD待測液與重鉻酸鉀反應(yīng)所得的吸光度幾乎沒有差別。說明煮沸不會使YPD溶液中的還原性物質(zhì)與重鉻酸鉀反應(yīng)的能力發(fā)生變化。

2.4 回收率及精密度實驗結(jié)果（表3）

由表3可知，在YPD溶液中添加20 g/L的乙醇，本法回收率為98.58%～102.14%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.52%（n=6），說明本法精密度良好。

2.5 發(fā)酵液、葡萄酒、啤酒中乙醇濃度的測定結(jié)果（表4）

如表4所示，用本法測定了5個樣品的乙醇含量。經(jīng)t檢驗，本方法所得結(jié)果與生物傳感器所測得的結(jié)果均沒有顯著差異，p＞0.05。本方法與生物傳感器法的差異為0.36%～1.74%,說明本方法準(zhǔn)確度良好。

表3 回收率及精密度試驗結(jié)果

表4 發(fā)酵液、葡萄酒、啤酒中乙醇濃度測定的結(jié)果

3 討論

本方法能準(zhǔn)確地測定發(fā)酵液中的乙醇含量。檢測的精密度、準(zhǔn)確度、回收率等各項指標(biāo)均達到分析要求。本法還能測定葡萄酒、啤酒等有色酒中的乙醇含量。

筆者在進行釀酒微生物相互作用的研究中，涉及發(fā)酵液中乙醇含量的測定，結(jié)合實驗室條件和有大量樣品需要測定的實際需求，建立了本測定方法。本方法可以同時處理多個樣品，不需要像氣相色譜法和液相色譜法那樣依次進樣，也不需要像密度瓶法、酒精計法那樣依次蒸餾，當(dāng)樣品量多時，本方法能節(jié)省大量檢測時間。

限于本方法的原理，目前不能排除甲醇、丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇等揮發(fā)性醇類對實驗結(jié)果的干擾，不過釀酒相關(guān)實驗和生產(chǎn)中所涉及的發(fā)酵液的乙醇含量遠遠高于其他揮發(fā)性醇，所以本方法適用于釀酒相關(guān)實驗和生產(chǎn)。本方法不需要昂貴的儀器設(shè)備，成本低廉，可以得到廣泛的應(yīng)用。

參考文獻：

[1]馮東,王丙蓮,梁曉輝,等.生物傳感器法快速測定酒中的乙醇含量[J].釀酒科技,2012(2)：83-86.

[2]趙洪慶,高紅波,鐘其頂,等.乙醇傳感器法測定葡萄酒和黃酒中乙醇的含量[J].食品工業(yè)科技,2014,35(19)：293-296.

[3]牟建樓,王頡,張偉,等.乙醇的測定方法綜述[J].釀酒,2006(2)：46-48.

[4]范繼青,陳念祖,黃滔敏.柱前衍生化-HPLC法測定乙醇消毒液中乙醇的含量[J].中國臨床藥學(xué)雜志,2016,25(2)：89-92.

[5]鄧少東,肖鳳霞.一種小鼠血清中乙醇含量測定的簡易方法[J].廣東醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2017,35(1)：33-35.

[6]葛奉娟,王欲曉,周俊,等.重鉻酸鉀氧化比色法和氣相色譜法定量分析發(fā)酵液中乙醇的比較研究[J].徐州工程學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版),2011,26(2)：64-68.

[7]何川,章登政,張俊,等.重鉻酸鉀-DNS比色法測定發(fā)酵液中乙醇含量[J].生命科學(xué)研究,2013,17(1)：1-4.