劉佳鑫，崔 穎，徐海棟

（1新疆維吾爾自治區(qū)昌吉市93864部隊(duì)醫(yī)院，新疆昌吉831112；2南京軍區(qū)南京總醫(yī)院，江蘇 南京210002）

0 引言

腰椎間盤突出是一種比較常見(jiàn)的疾病，而且隨著社會(huì)節(jié)奏的加快，該病患者人數(shù)每年都有所增長(zhǎng)，且呈現(xiàn)出年輕化發(fā)展的趨勢(shì)［1］。隨著人年齡的增長(zhǎng)，椎間盤會(huì)逐漸發(fā)生退變，纖維環(huán)和髓核的含水量逐漸下降，髓核失去彈性，纖維環(huán)逐漸出現(xiàn)裂隙。由于其發(fā)病機(jī)制尚不明確，防治手段尤其是預(yù)防手段尚不完善。所以，建立有效、成熟的動(dòng)物模型能夠幫助我們更好地了解和研究該病的發(fā)病機(jī)制，并對(duì)治療提供新的策略和方法。

因小鼠椎間盤與人類椎間盤在生理結(jié)構(gòu)和病理改變上具有相似性，同時(shí)小鼠飼養(yǎng)周期較短，存活率較高，故使用小鼠建立椎間盤退變模型最為理想。本文旨在討論一些近年來(lái)常用的、成功率較高的椎間盤退變模型實(shí)驗(yàn)進(jìn)展。

1 生物力學(xué)模型

1.1 去雙前肢直立模型 去雙前肢是指通過(guò)手術(shù)或其他方式改變小鼠的活動(dòng)方式，使其變成與人類相同的雙足直立，以此來(lái)改變其脊柱的生物力學(xué)狀態(tài)，椎間盤因壓力的增大和方向的變化逐漸發(fā)生退變，這與人類椎間盤退變的機(jī)制基本相同。劉盾等［2］將幼鼠雙前肢血管及神經(jīng)束結(jié)扎，然后將肱骨截?cái)啵p合傷口后繼續(xù)飼養(yǎng)。六月齡時(shí)處死并提取椎間盤標(biāo)本，經(jīng)染色后觀察，髓核出現(xiàn)皺縮，與纖維環(huán)界限不清，椎體表面產(chǎn)生裂痕，軟骨終板出現(xiàn)鈣化，腰椎間盤軟骨細(xì)胞發(fā)生變性、壞死，椎間盤高度降低。免疫熒光檢測(cè)顯示：CollagenⅠ、CollagenⅩ、TNF-α 陽(yáng)性細(xì)胞比例較正常小鼠均有明顯升高。

1.2 椎間盤加壓模型 通過(guò)在小鼠腰椎上直接增大壓力會(huì)導(dǎo)致小鼠椎間盤間壓力增大，進(jìn)而增大了髓核之間的壓力，纖維環(huán)的壓力也隨之增大，當(dāng)外界壓力超過(guò)椎間盤所承受的壓力上限時(shí)纖維環(huán)會(huì)逐漸發(fā)生破裂，髓核突出并發(fā)生退變。在此壓力增大的基礎(chǔ)上，髓核細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡，纖維環(huán)破裂，融媒體的活性相應(yīng)增加。Lindblom［3］構(gòu)建了世界上最早的椎間盤加壓模型。孫春光等［4］通過(guò)手術(shù)方法，以尾椎C5、C6為中心，將兩枚交叉克氏針鉆入尾椎。相繼固定定制碳纖維環(huán)于交叉克氏針上，給予彈簧螺帽固定加壓。壓縮4枚彈簧均為10 mm／kg體質(zhì)量（模擬小鼠直立行走時(shí)腰椎所承受的自身體質(zhì)量）彈。術(shù)后兩個(gè)月在MRI下發(fā)現(xiàn)椎體間椎間盤信號(hào)強(qiáng)度呈低強(qiáng)度改變，椎體周圍纖維環(huán)彎曲變形，椎間盤部位出現(xiàn)壓跡。

生物力學(xué)模型其優(yōu)勢(shì)在于能很好地模擬人類脊柱的生理特性，使小鼠椎間盤退變符合人類椎間盤退變的過(guò)程，可重復(fù)性高，可控性強(qiáng)。

2 物理?yè)p傷模型

2.1 纖維環(huán)穿刺法 纖維環(huán)穿刺法是目前最常用的動(dòng)物椎間盤造模方法。通過(guò)纖維環(huán)穿刺可以同時(shí)損傷纖維環(huán)和髓核，導(dǎo)致椎間盤的高度顯著下降，硬度明顯降低，同時(shí)內(nèi)部壓力減?。?］。 Issy 等［6］將 Wistar鼠麻醉后在X線引導(dǎo)下用20 g針經(jīng)皮穿入6-7、8-9尾椎椎間盤。針頭穿過(guò)髓核直到對(duì)側(cè)纖維環(huán)，然后360°旋轉(zhuǎn)兩次，靜置30 s后拔出。之后，在X線和MRI引導(dǎo)下測(cè)量損傷7、30 d后的椎間盤高度。同時(shí)使用蘇木素染色和膠原纖維取向進(jìn)行組織學(xué)檢查。最終影像學(xué)與組織學(xué)評(píng)分都能表明椎間盤的顯著退變。Ohnishi等［7］在經(jīng)典纖維環(huán)穿刺的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，利用Micro-CT對(duì)小鼠L4-5椎間盤進(jìn)行多維平面重建，確定椎間盤上的針刺區(qū)域。為了明確針刺的位置，將椎間盤平面正中的矢狀徑分為三部分，同心橢圓為中心區(qū)（central），外圍被分成腹側(cè)（ventral）和背側(cè)（dorsal）（圖 1）。

圖1 椎間盤平面示意圖

數(shù)周后處死小鼠，通過(guò)MRI分析證實(shí)針刺椎間盤發(fā)生退變性改變，將針刺部位椎間盤固定、包埋、切片、染色后利用四種經(jīng)典組織學(xué)分析方法分析，證明其退變性改變。這種通過(guò)針刺損傷中心區(qū)域的方法更有效地?fù)p傷纖維環(huán)，導(dǎo)致椎間盤的退變。利用針刺纖維環(huán)建立椎間盤退變模型是一種經(jīng)濟(jì)有效、操作簡(jiǎn)便、成功率高、重復(fù)性好的方法，模型椎間盤的緩慢退變與人類椎間盤退變的發(fā)展規(guī)律相似。

2.2 脊柱失穩(wěn)模型 在脊柱的穩(wěn)定因素中，骨骼和韌帶維持關(guān)節(jié)平衡和穩(wěn)定的作用稱為靜力平衡，肌肉維持該作用稱為動(dòng)力平衡。脊柱失穩(wěn)法是通過(guò)手術(shù)切除脊柱的棘突、關(guān)節(jié)突、椎板間韌帶等結(jié)構(gòu)，破壞靜力平衡和動(dòng)力平衡，改變正常脊柱和椎間盤的受力大小和分布，從而間接誘發(fā) IDD發(fā)生。Miyamoto等［8］建立了小鼠的脊柱失穩(wěn)椎間盤模型，主要是咬除棘突組織并同時(shí)松解椎旁肌肉組織，對(duì)模型行免疫組化及影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)骨贅增生，纖維結(jié)締組織形成，纖維環(huán)破碎。陳德勝等［9］通過(guò)切除鼠L1-L6棘突，關(guān)節(jié)突，棘上、棘間韌帶，切斷雙側(cè)豎脊肌來(lái)破壞脊柱后柱的穩(wěn)定性。在X線下發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組椎間隙狹窄，椎體不穩(wěn)，軟骨終板鈣化。病理示髓核細(xì)胞減少，外周纖維環(huán)纖維化樣變。

3 基因敲除模型

相比于手術(shù)方法獲得小鼠椎間盤模型，基因敲除模型具有數(shù)量多，可控性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。目前報(bào)道的基因敲除模型主要分為兩類，一類是敲除對(duì)椎間盤結(jié)構(gòu)決定性的相關(guān)基因，例如 Col9a1［10］、雙糖鏈蛋白聚糖［11］。還有一類是對(duì)椎間盤正常代謝過(guò)程中的相關(guān)基因進(jìn)行敲除，如核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因（ERCC1）［12］。 DNA 切除修復(fù)基因 ERCC1-XPF 的缺失會(huì)導(dǎo)致早衰癥或者是疾病的加速進(jìn)展，影響到皮膚、神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、肝臟、肌肉骨骼、血液和內(nèi)分泌系統(tǒng)［13］。相似的，Ercc1和 XPF之中任何一個(gè)的缺失都會(huì)加速小鼠的老化［14-16］，Hernández等［17］將缺乏核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因和著色性干皮病基因的小鼠模型和野生型老鼠共同飼養(yǎng)，20周后在Micro-CT和X線下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)缺乏核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因和著色性干皮病基因的小鼠的椎間盤減少的高度相當(dāng)于正常兩歲的小鼠，同時(shí)會(huì)表現(xiàn)出病理性的脊柱后凸，還包括骨礦物質(zhì)減少，椎體多孔性增加。

基因敲除模型是具有廣闊前景的建模辦法，其穩(wěn)定性強(qiáng)，可控性強(qiáng)，可獲得模型數(shù)量較大。但目前由于技術(shù)限制，其所花費(fèi)的時(shí)間和經(jīng)費(fèi)要多于其他方式。

4 化學(xué)損傷模型

Mao等［18］將不同劑量的磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）注入到椎間盤中，4周后在影像學(xué)、組織學(xué)及免疫組化檢測(cè)下提示鼠椎間盤發(fā)生了退變，同時(shí)發(fā)現(xiàn)椎間盤退變速度與注入的PBS劑量成正相關(guān)。Manuscript［19］將三個(gè)月大的小鼠直接暴露于煙草煙霧中來(lái)模擬人類的長(zhǎng)期吸煙，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些小鼠椎間盤內(nèi)蛋白聚糖含量降低，細(xì)胞衰老加快，椎體骨質(zhì)疏松、終板孔隙度增大，進(jìn)而導(dǎo)致椎間盤退變?；瘜W(xué)損傷模型雖然易操作，創(chuàng)傷小，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果受到單一變量的限制，同時(shí)又不符合人類的生理規(guī)律。

5 結(jié)語(yǔ)

以上建模方法是目前使用率和成功率較高的幾種方法，除此之外，汪國(guó)宏等［20］還利用人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus， HCMV）感染小鼠，HE 染色下見(jiàn)椎間盤組織局部灶性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等慢性炎癥反應(yīng)，纖維環(huán)板層結(jié)構(gòu)紊亂，關(guān)節(jié)軟骨鈣化層增厚，大量黏液及泡沫細(xì)胞，軟骨下血管明顯減少，證明了HCMV可以感染小鼠椎間盤組織。動(dòng)物椎間盤退變模型的建立對(duì)于了解人椎間盤的退變機(jī)制，對(duì)臨床治療和預(yù)防人椎間盤退變具有十分重要的的意義。年齡相關(guān)導(dǎo)致的變性疾病重要卻充滿了挑戰(zhàn)，因?yàn)樵谌祟愔惺苤朴谘芯繒r(shí)間長(zhǎng)和樣本量的大小，同時(shí)要考慮遺傳和環(huán)境的變量。所以，動(dòng)物模型的建立在現(xiàn)在以及未來(lái)的科研工作中都占據(jù)重要角色。

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