李 瓊，劉敏娟，何 丹，劉 歡，解 敏，王 挺，李 紅，李海波

（1南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院生殖與遺傳中心，江蘇蘇州215002；2廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司，廣東廣州510665）

0 引言

非整倍體與人類疾病關(guān)系的研究已逾50年的歷史，是人類發(fā)育障礙和智力殘疾最常見的遺傳原因［1］。染色體數(shù)目異常被認(rèn)為是最常見的自然流產(chǎn)病因［2-4］，給孕婦帶來了沉重的心理和生理的傷害［5］，且有些常染色體和性染色體非整倍體的胎兒能夠存活下來，這些患兒多伴隨嚴(yán)重的肢體、器官畸形和語(yǔ)言智力障礙，給家庭和社會(huì)造成了沉重的負(fù)擔(dān)。最常見的就是21三體、18三體、13三體以及性染色體異常。

自 1993年 Mansfield等［6］用定量熒光 PCR（quantitative fluorescent polymerase chain reaction，QF-PCR）進(jìn)行唐氏綜合征及其他染色體非整倍體檢測(cè)以來，QF-PCR技術(shù)被證明為一種快速、準(zhǔn)確、低成本、自動(dòng)化程度高的檢側(cè)染色體非整倍體的方法，在國(guó)外得到廣泛的應(yīng)用［7-9］。該方法是通過對(duì)染色體上多態(tài)性位點(diǎn)的短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過高分辨率膠電泳（如毛細(xì)管電泳等）對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離。由于引物的熒光信號(hào)強(qiáng)度和擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，產(chǎn)物量與模板量成正比，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)初始模板的相對(duì)定量，以對(duì)染色體數(shù)目異常進(jìn)行有效快速的產(chǎn)前診斷。

本研究采用QF-PCR方法與染色體核型分析方法對(duì)329例產(chǎn)前羊水標(biāo)本進(jìn)行檢側(cè)，考察新近國(guó)產(chǎn)QF-PCR試劑盒對(duì)常見染色體非整倍體病檢測(cè)中靈敏性、特異性和準(zhǔn)確性，評(píng)價(jià)其在染色體非整倍體快速產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 收集2016年3月至2016年12月因血清學(xué)篩查21／18染色體高風(fēng)險(xiǎn)、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)提示21／18／13／X／Y 染色體高風(fēng)險(xiǎn)、高齡或 B 超異常等原因在蘇州市立醫(yī)院生殖與遺傳中心進(jìn)行產(chǎn)前診斷的329例羊水樣本。孕婦年齡范圍19～43歲，其中35歲以下有189例（占57.45%），35歲及以上有140例（占42.55%）。在B超介導(dǎo)下進(jìn)行羊水穿刺取樣，羊水穿刺的孕周為16～22+6周，經(jīng)孕婦知情同意后，進(jìn)行G顯帶核型分析后單盲進(jìn)行QF-PCR檢測(cè)。

1.2 主要試劑 核酸提取或純化試劑（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）；臨床試驗(yàn)用21、18、13三體和性染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒（廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司）。

1.3 主要儀器 Applied Biosystems定性 PCR儀9700型；Applied Biosystems基因分析儀3500 Dx型。

1.4 方法

1.4.1 染色體核型分析 在超聲儀定位下，無(wú)菌操作行羊膜腔穿刺抽取羊水20 mL，置于2只無(wú)菌離心管中離心沉淀羊水細(xì)胞，接種培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。常規(guī)方法制備染色體、G顯帶，必要時(shí)行父母外周血染色體核型分析。用染色體分析軟件進(jìn)行分析，參考“人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制2016版”相關(guān)規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)（an international system for human cytogenetic nomenclature，ISCN 2016），用染色體圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)60個(gè)分裂相，鏡下分析10個(gè)核型，并2次復(fù)查。

1.4.2 QF-PCR 檢測(cè)位點(diǎn) QF-PCR 檢測(cè)采用 21、18、13及性染色體上的18個(gè)STR位點(diǎn)，其中21號(hào)染色體6個(gè)位點(diǎn)，18號(hào)染色體4個(gè)位點(diǎn)，13號(hào)染色體4個(gè)位點(diǎn)，性染色體4個(gè)位點(diǎn)，另外還包括牙釉蛋白基因（amelogenin，AMXY）和性別決定基因（homo sapiens sex determining region Y，SRY）2個(gè)基因位點(diǎn)。每一個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)引物對(duì)的上游或者下游引物用FAM（藍(lán)色）或HEX（綠色）熒光物質(zhì)標(biāo)記。20個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)按照21、18、13三體和性染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒（熒光PCR毛細(xì)管電泳法）說明書要求分A、B、C三組進(jìn)行，其中A組包括21號(hào)染色體6個(gè)STR位點(diǎn)（A1-A6）；B組包括 18號(hào)染色體4個(gè)STR位點(diǎn)（B1-B4）和13號(hào)染色體4個(gè)STR位點(diǎn)（B5-B8）；C組包括4個(gè) X染色體STR 位點(diǎn)（C2、C3、C5、C6）和2個(gè)性別基因位點(diǎn)（C1、C4）。

1.4.3 QF-PCR檢測(cè)步驟 主要操作包括：①DNA提?。喊凑罩猩酱髮W(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑的說明書進(jìn)行。②PCR擴(kuò)增：按照21、18、13三體和性染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒（熒光PCR毛細(xì)管電泳法）說明書操作，具體擴(kuò)增體系分三組，擴(kuò)增體積為 25 μL，擴(kuò)增反應(yīng)條件為 95℃5 min；隨后變性 95℃ 30 s，退火 58℃ 40 s，延伸 72℃50 s，共25個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。③毛細(xì)管電泳：取 1 μL PCR 產(chǎn)物和 13.5 μL 甲酰胺、0.5 μL GeneScanTM600 LIZ?Size standard v2.0（內(nèi)標(biāo)）混合，95℃變性5 mim，放置冰上至少1 min，用3500 Dx型基因分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

1.4.4 QF-PCR結(jié)果判斷及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 ①結(jié)果分析及判斷標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)3500 Dx型基因分析儀電泳得到的數(shù)據(jù)應(yīng)用GeneMapper?軟件進(jìn)行分析。根據(jù)既往大樣本陽(yáng)性、陰性樣本的統(tǒng)計(jì)得出：檢測(cè)位點(diǎn)為單峰或者兩個(gè)等位基因熒光峰面積比在0.8～1.4為正常樣本峰型，檢測(cè)位點(diǎn)為兩個(gè)等位基因熒光峰面積比在0.45～0.65或 1.8～2.4 或者三個(gè)等位基因熒光峰面積比接近1∶1∶1（最大峰面積與最小峰面積比值范圍為1～1.4）則為三體峰型。至少有兩個(gè)位點(diǎn)結(jié)果符合一個(gè)正常峰型才能解釋該反應(yīng)結(jié)果為陰性（圖1）；至少兩個(gè)位點(diǎn)結(jié)果符合一個(gè)三體峰型才能解釋該反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性（圖2）。②統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析選用所有符合試驗(yàn)方案要求的受試者樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，主要采用四格表整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。QF-PCR檢測(cè)結(jié)果和染色體核型分析結(jié)果對(duì)比采用Kappa一致性檢驗(yàn)，Kappa值的P≤0.01被認(rèn)為所檢驗(yàn)的結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 陰性結(jié)果示意圖（所有位點(diǎn)結(jié)果均為正常峰型，判斷該樣本為陰性）

圖2 陽(yáng)性結(jié)果示意圖——以21三體為例（A組有5個(gè)位點(diǎn)結(jié)果為三體峰型（A1、A3為雙峰，峰面積比在 1.8～2.4范圍內(nèi)；A2、A5、A6為三峰，峰面積比接近 1 ∶1 ∶1；A4多態(tài)性不能提供有效信息），綜合判斷該樣本為21三體陽(yáng)性）

2 結(jié)果

2.1 染色體核型分析結(jié)果 在檢測(cè)的329例羊水樣本中，染色體核型分析檢測(cè)到 21、18、13、X、Y 染色體非整倍體87例，其中1例為21，13羅伯遜易位型的21三體。正常核型242例，具體染色體核型分析分布情況統(tǒng)計(jì)如表1所示。

表1 樣本染色體核型分析結(jié)果分布情況統(tǒng)計(jì)

2.2 QF-PCR檢測(cè)結(jié)果 在檢測(cè)的329例羊水樣本中，QF-PCR檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性樣本87例，分別為21三體54例、18三體17例、13三體3例、性染色體非整倍體13例（XXX 7例，XXY 3例，XYY 3例）；陰性樣本242例。QF-PCR檢測(cè)與對(duì)比方法核型分析兩者檢測(cè)結(jié)果符合率為100%，但QF-PCR未能識(shí)別出是否為易位型的21三體。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 試驗(yàn)真實(shí)性評(píng)價(jià)：靈敏性、特異性、準(zhǔn)確性、Kappa值等指標(biāo)計(jì)算見表2。分別計(jì)算靈敏性、特異性、準(zhǔn)確性。 靈敏性＝87／（87+0）×100%＝100%，特異性＝242／（0+242）×100% ＝100%，準(zhǔn)確性＝（87+242）／（87+0+0+242）×100%＝100%。

Kappa值采用 SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Kappa值計(jì)算結(jié)果為 1.000（P＜0.01）。 結(jié)果表明QF-PCR檢測(cè)與核型分析兩者檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異，兩者檢測(cè)一致性極好。

表2 2種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性評(píng)測(cè)表

3 討論

染色體非整倍體是指相對(duì)于人的正常的46條染色體而言，細(xì)胞中的某一條或幾條染色體數(shù)目增加或減少，與嬰幼兒期顯著的發(fā)病率和死亡率有著密切關(guān)系。其中21三體（唐氏綜合征）、18三體（愛德華氏綜合征）、13三體（帕陶氏綜合征）和性染色體非整倍體（XXY綜合征、XYY綜合征等）分別是常染色體和性染色體臨床最常見染色體病。此類疾病通常具有智力低下、器官多發(fā)畸形或第二性征發(fā)育異常等臨床表現(xiàn)，且目前對(duì)染色體病尚無(wú)有效的治療措施，此類患兒的出生將給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)［10］。因此，通過產(chǎn)前診斷有效阻止染色體缺陷患兒的出生尤為重要。

臨床主要采用傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)對(duì)大多數(shù)患者進(jìn)行診斷，該技術(shù)雖然可以觀察整套染色體的數(shù)目和主要帶型，但這種方法操作繁瑣、耗費(fèi)人力、技術(shù)要求高，出報(bào)告時(shí)間長(zhǎng)（2～3周），易增加孕婦焦慮情緒，還可能會(huì)錯(cuò)過后續(xù)最佳醫(yī)學(xué)處理時(shí)機(jī)［11］。隨著分子診斷的發(fā)展，QF-PCR技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用越來越廣泛［11-15］，此技術(shù)可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)檢測(cè)常見的染色體數(shù)目異常，具有快速、準(zhǔn)確、低成本、高敏感性和高特異性的優(yōu)點(diǎn)，并且能夠自動(dòng)化操作。

本研究中329例產(chǎn)前診斷樣本，QF-PCR和對(duì)比方法（金標(biāo)準(zhǔn)染色體核型分析法）均檢測(cè)出陰性樣本242例，陽(yáng)性樣本87例，包括21三體54例、18三體17例、13三體3例、性染色體非整倍體13例（XXX 7例，XXY 3例，XYY 3例）。其中1例核型分析結(jié)果是21，13羅伯遜易位型的21三體，QF-PCR檢測(cè)結(jié)果為21三體，說明QF-PCR可以對(duì)羅伯遜易位型的21三體進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，但不能明確其為易位型，鑒于易位型21三體同常規(guī)21三體造成的臨床結(jié)局一致，是檢測(cè)目標(biāo)不同不屬于漏檢。本研究結(jié)果表明QFPCR技術(shù)在檢測(cè)這五種非整倍體上靈敏性、特異性和準(zhǔn)確性均為 100%，Kappa 值為 1.000（P＜0.01），兩者檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異，一致性好。

STR位點(diǎn)的合理選擇和體系設(shè)計(jì)可使QF-PCR檢測(cè)染色體非整倍體異常檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確可信［16］。本研究中QF-PCR檢測(cè)采用的是廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司研制開發(fā)的21、18、13三體和性染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒（熒光PCR毛細(xì)管電泳法），該試劑盒采用21、18、13及性染色體合計(jì)18個(gè)STR位點(diǎn)，其中21號(hào)染色體6個(gè)位點(diǎn)，18號(hào)染色體4個(gè)位點(diǎn)，13號(hào)染色體4個(gè)位點(diǎn)，性染色體4個(gè)位點(diǎn)，另外還包括牙釉蛋白基因（AMXY）和性別決定基因（SRY）2個(gè)基因位點(diǎn)。該試劑盒分三個(gè)體系同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，分別為A組（21號(hào)染色體）、B組（18和13號(hào)染色體，18和13號(hào)染色體上的位點(diǎn)顏色不同）和C組（性染色體），同一條染色體的位點(diǎn)集中在一個(gè)檢測(cè)體系中，使檢測(cè)易于實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果判讀的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化，降低人工操作和判斷的出錯(cuò)率。在329例QF-PCR檢測(cè)結(jié)果中，未出現(xiàn)單條染色體全部STR位點(diǎn)純合以致結(jié)果無(wú)法判讀的情況，核型分析檢測(cè)到的所有正常核型用QF-PCR檢測(cè)均無(wú)染色體數(shù)目異常，21、18、13、X及 Y五種染色體非整倍體用QF-PCR技術(shù)均可全部檢出，無(wú)假陽(yáng)性。說明該試劑盒針對(duì)選擇的位點(diǎn)及相應(yīng)數(shù)目合理，體系設(shè)計(jì)穩(wěn)定可行，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

以QF-PCR技術(shù)開發(fā)的國(guó)產(chǎn)化快速檢測(cè)試劑盒具有較好的靈敏性和特異性，可作為染色體核型分析的重要補(bǔ)充，優(yōu)化完善產(chǎn)前診斷體系，不論是減輕長(zhǎng)時(shí)間等待診斷結(jié)果給孕婦及其家屬帶來的心理壓力，還是幫助產(chǎn)科醫(yī)生及時(shí)做出處理措施方面都有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。因此，如果能將這一技術(shù)更好地與我國(guó)醫(yī)療實(shí)際相結(jié)合，必將更好地服務(wù)于臨床。

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