陳鳳霞，葉精精，姜 莉，王 航，呂潔婷，羅微微，馮振燦，程昌勇，宋厚輝

(浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院，浙江臨安 311300)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamoncoytogenes,Lm)簡稱單增李斯特菌，因其對鹽濃度、pH等理化因素不敏感而在自然界中廣泛存在，對人和動物的健康構(gòu)成很大的威脅[1-5]。2015年藍(lán)鈴公司生產(chǎn)的冰淇淋曾因其中存在李斯特菌而被緊急召回，2017年4月加拿大某公司生產(chǎn)的酸奶也因疑似污染李斯特菌被要求全部下架。該菌在4℃仍然可以增殖，因此冷藏食品成為該菌感染人類的重要傳播媒介。

單增李斯特菌作為胞內(nèi)寄生菌，其感染宿主細(xì)胞主要包括黏附與侵襲、逃逸吞噬體、胞內(nèi)增殖及細(xì)胞間遷移等諸多過程，且每一步均有相關(guān)的毒力因子參與[6]。

李斯特菌溶血素O(listeriolysin O，LLO)作為李斯特菌重要毒力因子主要介導(dǎo)細(xì)菌裂解并逃逸吞噬體，該蛋白由hly基因編碼，屬于依賴膽固醇的膜穿孔蛋白家族(CDCs)[7]，在酸性條件下可形成直徑為35 nm的孔狀結(jié)構(gòu)進(jìn)而插入到宿主細(xì)胞膜內(nèi)[8]。因此，當(dāng)李斯特菌包裹在吞噬體內(nèi)侵入細(xì)胞時，可借助LLO和磷脂酶A、B(PlcA和PlcB)的作用[9]，將吞噬體的膜破壞使其得以逃脫并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，導(dǎo)致其在胞內(nèi)能夠進(jìn)行增殖。由此可見，在細(xì)菌逃逸初級和次級吞噬體過程中LLO發(fā)揮著重要作用[7]。除此之外，LLO還能激活如鈣離子、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)[10-11]等信號通路。

盡管關(guān)于LLO功能的研究已較多，但該分子在發(fā)揮生物學(xué)功能過程中涉及的潛在分子機(jī)制尚待深入解析。本研究采用同源重組策略及質(zhì)?；匮a(bǔ)手段構(gòu)建出hly基因缺失株和回補(bǔ)株，并利用這些重組菌株進(jìn)一步探索和挖掘LLO參與李斯特菌感染、胞內(nèi)生存等生物學(xué)途徑的分子機(jī)理，為進(jìn)一步探索LLO在李斯特菌感染過程中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及培養(yǎng)條件 試驗(yàn)需用到的菌株有單增李斯特菌野生型EGD-e和大腸埃希菌DH5α，來自于Song’s Lab凍存庫。EGD-e菌株需要接種于牛腦心浸出液肉湯(brain heart infusion，BHI)，DH5α菌株需要接種于肉湯(luria-bertani，LB)，37℃振蕩過夜培養(yǎng)。

1.1.2 試劑和儀器 T4核酸連接酶、DNA標(biāo)準(zhǔn)品、經(jīng)典蛋白，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ，美國NEB公司產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物純化/回收試劑盒，上海萊楓生物科技有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；蛋白免疫印跡顯色液，伯尚生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；硝酸纖維膜，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司產(chǎn)品；山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP-tag，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑，美國BBI生命科學(xué)有限公司；質(zhì)粒pKSV7 Plasmid pKSV7，本實(shí)驗(yàn)室自存；李斯特菌裂解液，本實(shí)驗(yàn)室自配。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 對于缺失株的構(gòu)建，所用模板為EGD-e菌株全基因組(GenBank № NC-003210.1)，設(shè)計(jì)2對分別用于擴(kuò)增hly基因(lmo0202)上、下游同源臂序列的特異性引物(hly EGD-e up-fwd/rev和hly EGD-e down-fwd/rev)，同時為了后續(xù)缺失株的篩選，在距離上游同源臂100 bp左右設(shè)計(jì)1條引物(hly EGD-e up front)，并搭配引物hly EGD-e down-rev用于同源重組后基因交換驗(yàn)證。對于回補(bǔ)株的引物設(shè)計(jì)與缺失株的不同在于用到的是在EGD-e菌株全基因組、表達(dá)載體pIMK2和重組載體pSL251上都具有其識別位點(diǎn)的1對序列(hly EGD-e completion-fwd/rev)，本研究中用到的引物見表1。

表1 本研究中所用到的引物

1.2 方法

1.2.1 單增李斯特菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 挑取單克隆搖菌，培養(yǎng)過夜后吸取新鮮菌液1 mL放入100 mL 終濃度為0.5 g/mol的蔗糖與BHI混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h，加入已過濾除菌的青霉素G進(jìn)行篩選，約2 h后李斯特菌生長至對數(shù)期，適合做感受態(tài)細(xì)胞。用已過濾除菌的1 mg/mol HEPES+0.5 g/mol蔗糖混合液進(jìn)行洗滌，一般洗2次，第1次用25 mL，第2次用量減半，最后再用400 μL重懸。感受態(tài)細(xì)胞制備完畢，若需要備用則可分兩管凍存在-80℃。

1.2.2 EGD-e基因組的抽提 試驗(yàn)采用裂解、冰凍、煮沸再冰浴冷卻的方法，促使它破裂，釋放出基因組。先從試管里吸取過夜培養(yǎng)的菌液1 mL～2 mL到適合的離心管，以12 000 r/min 離心1 min。輕輕取出并用200 μL移液器吸取上清棄掉。然后用等體積的TZ和蒸餾水將沉淀菌體重懸，將混合物于-20℃靜置30 min后，立即放進(jìn)泡沫浮漂置于沸水中10 min，隨即冰浴進(jìn)行10 min的冷卻，再次離心后取其上清置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 hly基因缺失株Δhly的構(gòu)建

1.2.3.1 hly上、下游同源臂的擴(kuò)增 以EGD-e基因組為模板，采用1對上游引物hly EGD-e up-fwd/rev從李斯特菌EGD-e基因組中擴(kuò)增hly上游同源臂hly EGD-e up homoarm(539 bp)，1對下游引物hly EGD-e down-fwd/rev擴(kuò)增hly下游同源臂hly EGD-e down homoarm(541 bp)。利用引物hly EGD-e up fwdSalⅠ和引物hly EGD-e down revBamHⅠ通過SOE PCR將上、下游同源臂連接起來，得到hly EGD-e homoarms。

宮頸癌為臨床最常見的婦科惡性腫瘤,近些年來,隨著宮頸病變篩查的廣泛開展,近年來宮頸癌的發(fā)病率下對降低,但其發(fā)病卻有明顯年輕化趨勢,10%~15%的宮頸癌患者在生育期被診斷,其中包括許多未生育者[1]。對這些患者來講,保留生育功能是十分重要的,部分早期子宮頸癌的年齡患者有渴望保留生育功能的需要。選取2014年1月~2017年12月宮頸癌患者40例行根治性宮頸切除術(shù)治療治療的臨床療效分析進(jìn)行分析如下。

1.2.3.2 hly同源臂與pKSV7連接 將hly同源臂與pKSV7用BamHⅠ、SalⅠ進(jìn)行雙酶切，經(jīng)純化回收之后，用T4連接酶連接再轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α細(xì)胞中培養(yǎng)，通過驗(yàn)證，對得到的陽性克隆提質(zhì)粒，即可得到重組質(zhì)粒pSL081(圖1)。

1.2.3.3 hly基因缺失株的篩選 將質(zhì)粒pSL081電轉(zhuǎn)入EGD-e感受態(tài)細(xì)胞中，42℃、BHI/Chl抗性下，培養(yǎng)2代～3代，采用平板劃線和PCR驗(yàn)證，選出發(fā)生同源重組的陽性克隆。將陽性克隆在30℃、Chl抗性下，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，約10代后，在無抗的BHI平板上劃線。大約24 h，待平板上長出菌落后，用無菌牙簽挑取數(shù)個規(guī)則的單菌落同步接種于有氯霉素抗性和無抗性的BHI液體培養(yǎng)基或固體平板中培養(yǎng)。在沒有抗性的培養(yǎng)基中長勢良好，而對應(yīng)的在有氯霉素抗性的培養(yǎng)基中無法繁殖的即是試驗(yàn)缺失成功的菌株。

圖1 基因敲除載體pSL081的構(gòu)建Fig.1 Construction strategy of the recombinant plasmid pSL081 for hly gene deletion

1.2.4 hly的回補(bǔ)株CΔhly的構(gòu)建 為了證實(shí)缺失株Δhly的表型缺失是由于基因敲除造成的，利用表達(dá)載體pIMK2構(gòu)建了一個重組載體pSL251(構(gòu)建示意圖見圖2)，將其在25 μF、200 Ω、2 500 V條件下，用0.2 cm的電擊轉(zhuǎn)化杯電轉(zhuǎn)至李斯特菌缺失株Δhly的感受態(tài)細(xì)胞中。將菌液涂布于有氯霉素抗性的BHI固體平板，放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約12 h后，挑取單克隆，用引物進(jìn)行PCR，經(jīng)鑒定呈陽性的克隆送測序公司，測序成功后的菌株即為回補(bǔ)株，并將其命名為CΔhly。

圖2 李斯特菌hly基因回補(bǔ)株重組載體pSL251的構(gòu)建Fig.2 Construction strategy of the recombinant plasmid pSL251 for hly gene complementation

1.2.5 Δhly和CΔhly的鑒定及遺傳穩(wěn)定性測定 用引物hly EGD-e up front和hly EGD-e down revBamHⅠ進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證缺失株Δhly和回補(bǔ)株CΔhly，以檢測突變株是否發(fā)生缺失或回補(bǔ)不完全，并確定重組菌的遺傳穩(wěn)定性。預(yù)計(jì)野生型菌株和回補(bǔ)株CΔhly可以得到2 779 bp的片段，而缺失株Δhly預(yù)期得到1 189 bp的片段。

1.2.6 Western blot檢測 為了檢測缺失株Δhly和回補(bǔ)株CΔhly是否構(gòu)建成功，以及融合蛋白在重組菌株內(nèi)是否成功表達(dá)，利用抗原抗體特異性反應(yīng)原理，以LLO多克隆抗體為一抗，羊抗鼠IgG-HRP為二抗來檢測。具體操作時先挑取制備的缺失株Δhly和回補(bǔ)株CΔhly單克隆搖菌，收集菌體后進(jìn)行離心，分別獲得上清和沉淀，為了得到上清中的蛋白，用100 mL/L的TCA對上清進(jìn)行沉淀，為了得到菌體蛋白，超聲破碎將沉淀中的菌體裂解。得到蛋白后測定濃度，計(jì)算蛋白量與著色液的合適配比并以兩倍該體系分別加入蛋白與試劑，混合均勻，高溫煮沸5 min，將樣品瞬離使得一些碎片沉到試管底部，降低對下一步SDS-PAGE的影響，電泳后采用半干法轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，一抗二抗孵育，最后利用紫外線對蛋白進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 缺失株Δhly和回補(bǔ)株CΔhly的驗(yàn)證

采用菌液PCR技術(shù)，挑取在氯霉素抗性培養(yǎng)基中不生長而在無抗培養(yǎng)基中生長的單菌落進(jìn)行驗(yàn)證，用引物hly EGD-e up front和hly EGD-e down revBamHⅠ驗(yàn)證缺失株Δhly和回補(bǔ)株CΔhly。將所得產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，由圖3可知，與DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000相比，野生株EGD-e得到2 779 bp的片段，而缺失株Δhly是1 189 bp的片段。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000； EGD-e.野生株;1,3.缺失株Δhly陽性克?。?.陰性對照；4.回補(bǔ)株CΔhly陽性克隆

M.DNA Marker DL 2 000； EGD-e.Wild strain；1,3. Δhly KO candicates；2. Negative control; 4. CΔhly KO candicate

圖3單增李斯特菌EGD-e、缺失株Δhly和回補(bǔ)株CΔhly的PCR驗(yàn)證

Fig.3 Identification of EGD-e,Δhly and CΔhly mutants by PCR

2.2 缺失株Δhly序列測定與分析

本研究設(shè)計(jì)缺失的序列為GenBank中公布的hly基因整個ORF區(qū)(1 590 bp，NC-003210)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證缺失株Δhly的構(gòu)建情況，采用核苷酸測序分析發(fā)現(xiàn)，與野生型EGD-e的hly基因兩側(cè)序列比較，本研究構(gòu)建的缺失株Δhly正好缺失了該基因的整個ORF區(qū)(1 590 bp)，與預(yù)期完全一致(圖4)，該結(jié)果進(jìn)一步確證缺失株Δhly構(gòu)建成功，可以用于下一步試驗(yàn)研究。

2.3 重組菌株Western blot檢測

3 討論

單增李斯特菌LLO是該菌感染宿主過程中至關(guān)重要的毒力因子，且對宿主細(xì)胞具有毒性[12]。已有研究證實(shí)LLO能夠在各種人類組織細(xì)胞(如鼠BMDM與J774和人Caco-2細(xì)胞)中協(xié)助細(xì)菌逃逸吞噬體[13]。目前有研究表明，雖然LLO與細(xì)菌磷脂酶PC-PLC為裂解宿主細(xì)胞吞噬體膜所必需的蛋白，但單增李斯特菌可以通過腸道派伊爾結(jié)上的M細(xì)胞進(jìn)入感染宿主細(xì)胞內(nèi)[14]而不依賴于LLO的作用。基于這一研究結(jié)果，筆者認(rèn)為更有構(gòu)建Δhly和CΔhly的必要性。在此基礎(chǔ)上，下一步將開展LLO生物學(xué)特性分析、Δhly毒力分析及致病機(jī)理的深入研究，以期解析LLO在單增李斯特菌增殖過程中所發(fā)揮功能的潛在分子機(jī)制及在沒有LLO表達(dá)的情況下，單增李斯特菌如何進(jìn)入被感染的宿主細(xì)胞內(nèi)增殖，比較兩者的區(qū)別及增殖途徑的異同。本研究查閱大量文獻(xiàn)做試驗(yàn)，詳細(xì)記錄了構(gòu)建單增李斯特菌hly基因缺失株和回補(bǔ)株的方法，成功構(gòu)建出缺失株Δhly和回補(bǔ)株CΔhly，可為初步接觸分子生物學(xué)領(lǐng)域的學(xué)子提供參考，也為進(jìn)一步探究LLO蛋白的生物學(xué)功能奠定重要基礎(chǔ)，為探索和挖掘LLO參與李斯特菌感染、胞內(nèi)生存等生物學(xué)途徑的分子機(jī)理提供試驗(yàn)材料。此外，有學(xué)者將李斯特菌用于疫苗開發(fā)和研究[15]，作為載體通過表達(dá)各種免疫蛋白來啟動細(xì)胞免疫，故本研究成功構(gòu)建的缺失株Δhly也可為單增李斯特菌用于疫苗載體研究提供可行性方案。

圖4 缺失株Δhly測序鑒定結(jié)果Fig.4 Verification of Δhly mutant by sequencing

圖5 單增李斯特菌EGD-e、缺失株Δhly和回補(bǔ)株CΔhly中LLO的表達(dá)分析Fig.5 Western blot analysis of LLO expression in the wild-type strain EGD-e and the mutant strains Δhly and CΔhly

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