卓曉沁,趙慧瑩,何國慶

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310058)

納豆作為特色發(fā)酵豆制品,因其獨特的滋氣味深受消費者喜愛。納豆產(chǎn)品的保健功效不斷受到關(guān)注,如它的抗腫瘤、抗氧化[1]和降血壓等保健功能[2];納豆對心腦血管疾病有潛在的防治作用[3],Ji等[4]探討了納豆激酶對腦缺血的作用機制。

鷹嘴豆(Chickpea)起源于中東和亞洲西部地區(qū),是世界第二大消費豆類[5]。鷹嘴豆富含不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、氨基酸和粗纖維等營養(yǎng)素,以及核黃素、煙酸、硫胺素、葉酸等重要維生素[6-8],其發(fā)酵產(chǎn)物中的11S蛋白質(zhì)可以降血脂[9],正釩酸鈉孵育的富釩鷹嘴豆芽可降血糖、改善脂質(zhì)代謝[10]并調(diào)節(jié)膽固醇[11],鷹嘴豆白蛋白水解物可以使超氧化物歧化酶活性顯著升高,并有降低腫瘤體積、抑制腫瘤[12]等功能。鷹嘴豆作為食藥功能兼?zhèn)涞氖称?在發(fā)酵工藝中應(yīng)用范圍十分廣泛。除了鷹嘴豆乳制品的發(fā)酵[13],更多則是應(yīng)用在納豆發(fā)酵中。根據(jù)底物形態(tài)不同,納豆發(fā)酵分為固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵。固態(tài)發(fā)酵中,衛(wèi)拯友等[14]將鷹嘴豆代替黃豆,分離出優(yōu)良的發(fā)酵用菌,采用傳統(tǒng)納豆生產(chǎn)工藝研制出口感更好的納豆,降低拉絲和氨味,其納豆激酶活力為727 U/g,比大豆納豆提高142%左右。趙倩楠[15]以生物量和納豆激酶活性為指標(biāo),通過正交實驗直觀分析得出:鷹嘴豆浸泡時間20 h、接種量1.5%、固態(tài)發(fā)酵16 h,納豆激酶酶活為21.6×102IU/g。液態(tài)發(fā)酵中,肖萍等[16]采用篩選分離所得的菌株確定了最優(yōu)培養(yǎng)基成分:蔗糖50.0 g/L,鷹嘴豆34.85 g/L,氯化鈣0.42 g/L,硫酸鎂0.35 g/L,磷酸氫二鉀5.00 g/L,磷酸二氫鉀6.00 g/L,優(yōu)化后溶纖酶活力為3210 U/mL,比出發(fā)培養(yǎng)基提高了2.10倍。

目前日本在納豆相關(guān)產(chǎn)品的研究方面在世界上處于領(lǐng)先水平,而我國納豆發(fā)酵技術(shù)的掌握程度參差不齊。受發(fā)酵菌種的生長、制作工藝及產(chǎn)品保存特殊性的約束,納豆產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)在我國未得到普遍推廣,關(guān)于納豆的多樣化研究在整體水平上有待提高。此外,如何提高納豆產(chǎn)品中的蛋白酶活力也是亟待解決的關(guān)鍵技術(shù)之一。

基于此,本研究以鷹嘴豆為主要發(fā)酵原料,以蛋白酶活力為指標(biāo)對鷹嘴豆納豆的發(fā)酵效果進(jìn)行考察,優(yōu)化液態(tài)納豆發(fā)酵培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和發(fā)酵條件,以期提高納豆激酶和蛋白酶活力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鷹嘴豆 市售；枯草納豆芽孢桿菌(Bacillussubtilisnatto)SG菌株 由浙江大學(xué)浙江省食品微生物重點實驗室保藏;鷹嘴豆、黃豆粕 食品級,市售;纖維蛋白原、凝血酶(1000 U) 北京索萊寶科技有限公司;瓊脂糖 西班牙BIOWEST公司;蛋白胨 生工生物工程(上海)股份有限公司;氯化鈉、葡萄糖、牛肉膏 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

PK-S28電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;756PC型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;BSA124S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;R134A冷凍離心機 德國Eppendorf公司;ZHWY-2102恒溫?fù)u床 上海智城分析儀器制造有限公司;CTHI-250B恒溫恒濕培養(yǎng)箱 施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司;SJB-CJ-1FX超凈工作臺 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司;UPR純水儀 西安優(yōu)普(Ulupure)儀器設(shè)備有限公司;600Y多功能粉碎機 鉑歐五金廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 鷹嘴豆粉、豆粕粉的制備 將鷹嘴豆和豆粕用制粉機分別打磨,100目過篩備用。

1.2.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基:牛肉膏6 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂20 g,加水至1000 mL,pH7.5;種子培養(yǎng)基:牛肉膏10 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g,加水至1000 mL,pH7.5;發(fā)酵培養(yǎng)基:鷹嘴豆粉、豆粕粉及其它材料按需添加,加水至1000 mL,自然pH。發(fā)酵培養(yǎng)基的對照組為鷹嘴豆粉45 g,加水至1000 mL,自然pH。以上培養(yǎng)基均121 ℃、20 min滅菌后使用。

1.2.3 種子培養(yǎng) 將4 ℃保藏的枯草芽孢桿菌種經(jīng)斜面培養(yǎng)基于37 ℃活化培養(yǎng)18～24 h,取一環(huán)菌種接入種子培養(yǎng)基中,以生長溫度37 ℃,轉(zhuǎn)速200 r/min的條件培養(yǎng)18 h。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng) 根據(jù)發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量,將一定比例的種子培養(yǎng)基接種至其中,在一定溫度、轉(zhuǎn)速等條件下?lián)u床發(fā)酵,測定蛋白酶活力。對照組裝液量100 mL/500 mL,發(fā)酵溫度37 ℃,轉(zhuǎn)速200 r/min。

1.2.5 酶活檢測

1.2.5.1 蛋白酶活力 Folin酚法[17]。

1.2.5.2 納豆激酶酶活 納豆激酶是一種可分泌至胞外且具有高效溶栓能力的絲氨酸蛋白酶,1987年首次被日本Sumi H人發(fā)現(xiàn)并命名[18]。在Astrup法[19-21]的基礎(chǔ)上對纖維蛋白平板的制備進(jìn)行改進(jìn)。將纖維蛋白源和凝血酶分別溶于pH=4磷酸鹽緩沖液中,制成0.89 mg/mL可凝結(jié)纖維蛋白溶液和7.5 U/mL的凝血酶溶液;取可凝結(jié)纖維蛋白溶液15 mL、凝血酶1 mL及瓊脂糖(0.5%)20 mL于50 ℃水浴加熱15 min,充分混合后倒入直徑為9 cm平板中冷卻備用。纖維蛋白平板法的檢測結(jié)果受孵育時間、平板厚度、測量誤差等因素的影響,因此納豆激酶酶活僅可作為輔助指標(biāo),用以檢測優(yōu)化結(jié)果的準(zhǔn)確性[22]。

1.2.6 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.6.1 單因素實驗 速效碳、氮源:該部分只考慮單一因素對發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶活力的影響。主要原料鷹嘴豆粉中速效碳源含量低,擬添加速效碳源以促進(jìn)菌體早期繁殖,并添加氮源以完善營養(yǎng)。分別采用單因素實驗比較碳、氮源對產(chǎn)蛋白酶的影響,其中麥芽糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖等碳源添加量為0.6%,豆粕粉、蛋白胨、魚蛋白胨、黃豆粉等氮源添加量為1%。接種量:為考察種子液接入量對納豆枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶活力的影響,在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入種子液的體積分?jǐn)?shù)分別為2%、3%、5%和8%。鹽離子:為考察鹽離子對蛋白酶活力的影響,在培養(yǎng)基中分別加入氯化鈣、硫酸鎂、磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀四種不同的鹽離子,添加量為0.01%。

1.2.6.2 Plackett-Burman法篩選影響產(chǎn)蛋白酶的重要因素 影響納豆芽孢桿菌發(fā)酵鷹嘴豆產(chǎn)生蛋白酶的因素有碳源、氮源、接種量、裝液量、搖瓶轉(zhuǎn)速、氯化鈣、葡萄糖、氯化鈉等,因為因子數(shù)眾多，且未確定各因子對因變量的影響程度，故采用Plackett-Burman法,以蛋白酶活力為指標(biāo)篩選顯著影響發(fā)酵的因素,因素水品設(shè)計見表1。PB實驗設(shè)計中另設(shè)3個虛擬列C、F和I,以考察實驗誤差。

表1 Plackett-Burman因素及水平設(shè)計Table 1 Factors and level design of Plackett-Burman

1.2.6.3 最陡爬坡實驗 為使響應(yīng)面實驗在臨近最佳數(shù)值時建立有效的響應(yīng)面方程[23],爬坡實驗把變量的變化趨勢作為爬坡方向,依據(jù)各自變量的數(shù)值大小確定步長,方可快速有效地接近最高點。實驗設(shè)計見表2。

表2 最陡爬坡實驗設(shè)計Table 2 Experimental design of steepest climbing method

1.2.6.4 Box-Behnken實驗與響應(yīng)面優(yōu)化 根據(jù)Plackett-Burman和最陡爬坡實驗的結(jié)果,設(shè)計Box-Behnken實驗的因素與水平(見表3),以蛋白酶活力為指標(biāo),輔以納豆激酶檢測值為驗證,篩選出對液態(tài)鷹嘴豆納豆發(fā)酵影響效果最顯著的3個因素,設(shè)計3因素3水平的中心組合實驗設(shè)計[24],并與響應(yīng)面優(yōu)化相結(jié)合,進(jìn)一步考察這三個因素不同水平下不同組合對鷹嘴豆納豆產(chǎn)蛋白酶能力的影響。

表3 響應(yīng)面分析方法因素與水平設(shè)計Table 3 The factors and levels of response surface analysis

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗中每組數(shù)據(jù)重復(fù)3次,用SAS、SPSS 17.0及Excel處理數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

結(jié)果見圖1所示。不同碳源對納豆枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶活力的影響見圖1(a)。添加蔗糖和淀粉不利于納豆枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶,甚至有抑制作用;但麥芽糖和葡萄糖可有效促進(jìn)納豆菌產(chǎn)蛋白酶,分別比對照組提高15%和23%,這與Gul等[25]的結(jié)果一致,即微生物最易利用單糖。據(jù)此,選用葡萄糖作為速效碳源。

不同氮源對納豆枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶活力的影響見圖1(b)。添加蛋白胨和魚蛋白胨后的酶活低于對照組;添加黃豆粉后,酶活并無明顯提高;添加豆粕粉后,蛋白酶活力提高38.5%。據(jù)此,選用豆粕粉作為外加氮源。

由圖1(c)可知,當(dāng)種子液接入量為2%時蛋白酶活力最高,接種量為3%和5%時蛋白酶活力有所下降,而8%時雖有升高,但仍不及2%組。其原因可能是當(dāng)接入量過低時,菌體生長較慢,過高則加速消耗發(fā)酵底物。因此以2%的接種量進(jìn)行后續(xù)實驗。

如圖1(d)所示,添加氯化鈣和硫酸鎂的酶活分別為832和815 U/mL,均高于對照組;添加磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀的蛋白酶活力分別為784 U/mL和682 U/mL低于對照組。因此選擇添加氯化鈣進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 基于Plackett-Burman法的培養(yǎng)基與發(fā)酵條件篩選結(jié)果

PB實驗設(shè)計與結(jié)果見表4,各參數(shù)及水平見表5。

表4 n=12的Plackett-Burman實驗設(shè)計與結(jié)果Table 4 The experimental design and results of n=12 Plackett-Burman

表5 Plackett-Burman實驗因素、水平及其效應(yīng)Table 5 Factors,levels and effects of Plackett-Burman

表5結(jié)果顯示,該PB模型極顯著(p<0.0001)。A(裝液量)與Y(蛋白酶活力)呈負(fù)相關(guān),這是由于納豆芽孢桿菌為好氧細(xì)菌,減少裝液量可增大空氣接觸面,提高溶氧量。同理,B(轉(zhuǎn)速)與蛋白酶活力呈正相關(guān)。D(鷹嘴豆粉添加量)作為主要碳氮源,為菌體生長繁殖提供營養(yǎng),且與Y呈顯著正相關(guān);E(豆粕粉)對Y有較小的影響,可能因為鷹嘴豆本身富含蛋白質(zhì),但豆粕粉中大豆蛋白的小分子物質(zhì)起到前期誘導(dǎo)的作用[26]。此外,J(葡萄糖)、K(氯化鈉)對結(jié)果無顯著影響,為避免其效應(yīng)是在影響更大因素的存在下被忽略,因此二者的添加量保持不變;H(接種量)對結(jié)果有負(fù)效應(yīng),可能由于接種量較大時發(fā)酵前期菌體的生長繁殖會消耗大量營養(yǎng)物質(zhì),導(dǎo)致酶的合成過程中營養(yǎng)相對不足,但接種量太低會延長微生物繁殖時間,酶活高峰期延后到來,后續(xù)實驗仍保持2%的種子液接入量,該結(jié)果與Li等[27]的研究相同。由文獻(xiàn)知,豆粕粉、葡萄糖作為速效碳氮源,可縮短微生物的延滯期[28-29]。G(氯化鈣)在PB實驗中為負(fù)效應(yīng),本實驗以食品工業(yè)生產(chǎn)為方向,本著健康天然、減少添加的原則,后續(xù)實驗不添加氯化鈣。因此本實驗其余因素分別采取豆粕粉1.0%、葡萄糖0.6%、氯化鈉0.5%、接種量2%。

2.3 最陡爬坡實驗

Plackett-Burman結(jié)果表明,對鷹嘴豆納豆液體發(fā)酵影響最大的3個因素分別是裝液量、轉(zhuǎn)速和鷹嘴豆粉添加量。最陡爬坡實驗結(jié)果見表6。以逼近最大酶活區(qū)域的3號條件作為下一步實驗基準(zhǔn),即裝液量70 mL/500 mL、轉(zhuǎn)速230 r/min、鷹嘴豆粉含量5.5%。

表6 最陡爬坡實驗結(jié)果Table 6 The results of steepest climbing method

2.4 Box-Behnken實驗與響應(yīng)面優(yōu)化

在最陡爬坡實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,采取三因素三水平分析方式,并對裝液量Z1、轉(zhuǎn)速Z2、鷹嘴豆粉添加量Z3做如下變換:X1=(Z1-70)/10,X2=(Z2-230)/20,X3=(Z3-5.5)/1,以X1、X2、X3為自變量,以蛋白酶活力為響應(yīng)值Y,實驗方案及結(jié)果見表7。

表7 響應(yīng)面分析實驗方案及結(jié)果Table 7 Experimental program and results

通過Minitab 17對結(jié)果進(jìn)行方差分析,并得到二次多項回歸擬合實驗數(shù)據(jù):

Y=3137.20+122X1+296.38X2+53.38Z3+61.25X1X2+17.75X1X3+50X2X3-156.35X12-11.10X22-130.1X32。

由表8知,所選模型之間處理方式有顯著差異(p<0.05)。在線性影響效應(yīng)中X1(裝液量)和X2(轉(zhuǎn)速)的p<0.05,說明裝液量與轉(zhuǎn)速對蛋白酶活的效應(yīng)顯著,而X3(鷹嘴豆粉添加量)的效應(yīng)不顯著。ATP等高能化合物為細(xì)胞生長與酶合成提供能量[30],充足的氧氣才能降解碳氮源以產(chǎn)生ATP,確保溶氧量是基礎(chǔ)。延滯期在速效碳氮源的作用下縮短之后,細(xì)胞開始分解利用非速效碳氮源。當(dāng)使用較稀或較易利用的培養(yǎng)基時,細(xì)胞的生長往往使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)過早耗盡,導(dǎo)致微生物細(xì)胞過早自溶,使發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量降低[31]。鷹嘴豆粉可維持培養(yǎng)基的濃度,不至于被過快分解。二次項系數(shù)A2影響極顯著(p<0.01),C2影響顯著(p<0.05),說明裝液量與鷹嘴豆粉添加量對蛋白酶活有重要影響,導(dǎo)致曲面效應(yīng)顯著,具體實驗因子對響應(yīng)值變化的影響較復(fù)雜。交互項的交互效應(yīng)p值均大于0.05,說明兩兩交互效應(yīng)不顯著。失擬項不顯著p=0.2014,模型顯著，擬合度良好?；貧w方程的響應(yīng)面圖見圖2。每張圖都是兩個交互因素的響應(yīng)面,每個響應(yīng)面都存在最高點。250 r/min已達(dá)到本實驗室搖床的最高水平,故設(shè)定250 r/min為最高轉(zhuǎn)速。

表8 Box-Behnken實驗方差分析Table 8 Variance analysis of Box-Behnken

圖2 鷹嘴豆納豆液態(tài)發(fā)酵條件的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface of submerged fermentation condition of chickpea natto

由圖2(a)可知,蛋白酶活隨轉(zhuǎn)速的提高在250 r/min達(dá)到最高;裝液量對蛋白酶活力的影響呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,低裝液量60/500 mL易增加發(fā)酵液的蒸發(fā),培養(yǎng)基底物較快消耗完畢,菌體進(jìn)入穩(wěn)定和自溶,而80/500 mL則溶氧降低、菌體生長密度和液體剪切力等均受影響,因此二者的響應(yīng)值明顯低于70/500 mL。由圖2(b)可知,鷹嘴豆粉添加量為4.5%和6.5%時蛋白酶活力較低,而添加量為5.5%時較高,蛋白酶活力先上升后下降。鷹嘴豆粉含量決定發(fā)酵液的濃稠程度,太濃或太稀均不利于菌體生長。溶氧率更多取決于轉(zhuǎn)速,因此蛋白酶活力隨轉(zhuǎn)速的提高而明顯上升。由圖2(c)可知,在裝液量和鷹嘴豆粉添加量的交互作用下,裝液量和鷹嘴豆粉添加量對蛋白酶活力影響的趨勢相同,為先增后減,二者的交互作用明顯,并存在最高點。

SAS分析獲得最高酶活的發(fā)酵方案是裝液量76 mL/500 mL、轉(zhuǎn)速250 r/min、鷹嘴豆粉添加量5.9%,其他條件和添加量保持不變,此條件下預(yù)測的酶活是3501.1 U/mL。該模型的驗證結(jié)果是(3558.0±1.5) U/mL,誤差=1.6%±0.053%<2.0%,故該模型穩(wěn)定,優(yōu)化后的回歸方程適合用于納豆枯草芽孢桿菌發(fā)酵鷹嘴豆產(chǎn)蛋白酶活力的分析和預(yù)測。

2.5 納豆激酶的輔助驗證

隨機取多組離心處理的發(fā)酵液于纖維蛋白平板上孵育18 h之后測量溶解圈直徑。相同條件下溶解圈直徑越大,納豆激酶活力越強。纖維蛋白平板法輔助驗證Folin酚法的結(jié)果見圖3,納豆芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶活力與其納豆激酶活力趨勢基本相同,由分析可知,二者有78.1%的相關(guān)性(p=0.001),纖維蛋白平板法的驗證結(jié)果較可靠。對照培養(yǎng)基與優(yōu)化培養(yǎng)基的納豆激酶溶解圈對比如圖4所示,其中對照培養(yǎng)基的納豆激酶溶解圈直徑為36.0 mm,優(yōu)化培養(yǎng)基的納豆激酶溶解圈直徑為52.0 mm,后者的面積是前者的2.08倍,說明培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化后納豆激酶活力有所提高。因此在兩種方法檢測下,液態(tài)發(fā)酵的優(yōu)化效果更具有說服力。

圖3 纖維蛋白平板法輔助驗證Folin酚法的參照Fig.3 The reference of Folin Phenol method by fibrin plate method

圖4 對照培養(yǎng)基與優(yōu)化培養(yǎng)基的納豆激酶溶解圈對比Fig.4 Comparison of dissolved circle between control medium and optimized medium注:A為對照培養(yǎng)基的納豆激酶溶解圈,B為優(yōu)化培養(yǎng)基納豆激酶溶解圈,ΦA(chǔ)=36 mm,ΦB=52 mm。

3 結(jié)論

在大量預(yù)實驗的基礎(chǔ)上篩選速效碳氮源,優(yōu)化了鷹嘴豆納豆液態(tài)發(fā)酵工藝。由單因素實驗得到:添加氮源為葡萄糖,添加氮源為豆粕。在Plackett-Burman實驗基礎(chǔ)上得到,裝液量、轉(zhuǎn)速和鷹嘴豆粉添加量的影響最為顯著。

經(jīng)優(yōu)化得到鷹嘴豆納豆液態(tài)發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基為:鷹嘴豆粉添加量5.9%,豆粕粉1.0%,葡萄糖0.6%,氯化鈉0.5%;培養(yǎng)條件:裝液量76 mL/500 mL、溫度37 ℃,轉(zhuǎn)速250 r/min,得到的蛋白酶活力為(3558.0±1.5) U/mL。相較于空白對照組,蛋白酶活力提高42.8%,通過纖維蛋白平板法的驗證,納豆激酶溶解圈面積提高了108.6%。該優(yōu)化培養(yǎng)基提高豆粕的利用率,拓寬豆粕的利用范圍和鷹嘴豆發(fā)酵納豆的新思路,不僅培養(yǎng)基的營養(yǎng)更全面,也為后續(xù)提純納豆激酶的可能性、功能性納豆食品的研發(fā)及發(fā)酵罐的放大生產(chǎn)打下科學(xué)基礎(chǔ)。

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