張先昂,賀 笑,劉小珍,葉琴霞,黃彩雙,文麗輝,張漢堯,*

(1.西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南昆明 650224;2.安徽師范大學(xué)生命科學(xué)院,安徽蕪湖 241000)

葡萄酒是酵母、細(xì)菌和其他真菌中復(fù)雜相互作用的產(chǎn)物,它們始于葡萄汁并且繼續(xù)發(fā)酵直至最終成為葡萄酒[1-3]。發(fā)酵的酵母種類,主要是由葡萄表面所攜帶的酵母種類和葡萄酒加工過程中添加的酵母種類所決定的。釀酒酵母是公認(rèn)的主要用于葡萄酒釀造的微生物[4]。然而,其他酵母屬種(Saccharomycesnon-cerevisiae yeasts,SNC),也可以在葡萄酒的發(fā)酵中發(fā)揮重要的作用。葡萄酒釀造中貝酵母的使用頻率低于釀酒酵母,但是在一些葡萄酒產(chǎn)區(qū),葡萄酒需在較低的溫度條件下發(fā)酵，貝酵母的生產(chǎn)效率比釀酒酵母高。例如:西班牙的巴斯克地區(qū)[5]、法國(guó)的阿爾薩斯[6]、蘇玳的盧瓦爾河谷[7]、意大利的瓦爾波利塞拉[8]和烏克蘭的雅爾塔[9]等地區(qū)生產(chǎn)的長(zhǎng)相思白葡萄酒。在過去的幾年中,由于目前的市場(chǎng)需求和氣候變化對(duì)葡萄酒質(zhì)量的影響,釀酒廠正面臨著新的挑戰(zhàn),貝酵母將有助于解決這些挑戰(zhàn)。它在低溫下表現(xiàn)出良好的發(fā)酵能力,產(chǎn)出具有低級(jí)醇和更高甘油含量的葡萄酒[10-12]。

在葡萄酒生產(chǎn)過程中,乙醇是我們所需要的重要次生代謝物。但是當(dāng)在發(fā)酵過程中乙醇的含量增加時(shí),會(huì)影響細(xì)胞體外滲透壓并且抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和活性,會(huì)對(duì)酵母正常生存和代謝產(chǎn)生影響[13]。釀酒酵母的ADR1基因編碼過氧化物酶蛋白,這種過氧化氫利用乙醇作為底物,氧化后使乙醇這種對(duì)酵母本身有毒性的物質(zhì)變成無毒性的物質(zhì)——乙醛,同時(shí)也使H2O2進(jìn)一步變成無毒的H2O[14]。同時(shí),發(fā)酵性糖積累過多時(shí)，不僅使乙醇積累過多對(duì)酵母產(chǎn)生毒害,而且會(huì)使酵母發(fā)生葡萄糖阻遏作用。這也會(huì)給其他有害菌生長(zhǎng)創(chuàng)造條件,生成其他物質(zhì),降低出酒率和酒的品質(zhì)。以往的研究表明,ADR1轉(zhuǎn)錄的mRNA和ADR1-b-galactosidase融合蛋白在葡萄糖抑制期間被發(fā)現(xiàn),這種ADR1蛋白的活動(dòng)被控制翻譯后修飾水平去適當(dāng)?shù)腁DH2的表達(dá)。ADR1-b-galactosidase融合蛋白可以在葡萄糖阻遏作用期間激活A(yù)DH2的表達(dá)并且顯著提高ADH2基因的脫抑制能力。當(dāng)ADR1在多拷貝質(zhì)粒上表達(dá)時(shí)也獲得相似的結(jié)果[15-21]。這就表明，ADR1基因在含糖量高的情況下可以破除葡萄糖阻遏的作用,并且提高酵母的乙醇代謝,從而消耗次生代謝物,使葡萄酒的酒精含量增加,使葡萄酒的風(fēng)味更佳。

本研究對(duì)貝酵母ADR1基因進(jìn)行了克隆,并利用在線分析工具ProtParam、ProtScale、TMHMM、PredictProtein、Swiss-Model等軟件對(duì)其編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析,同時(shí)預(yù)測(cè)了該基因所編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu),以分析貝酵母ADR1基因功能,為進(jìn)一步利用貝酵母ADR1基因打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

貝酵母菌株BZL05 以產(chǎn)自香格里拉的葡萄皮上分離而出；酵母膏、蛋白胨、瓊脂、葡萄糖、溶細(xì)胞酶 天根生化科技有限公司;上樣緩沖液、核酸染料 百泰克公司;100 bp DNA Marker 博邁德公司;dNTPs Mixture、Taq polymerase 紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司;引物合成 均由上海生工公司完成。

DK98-1數(shù)顯恒溫水浴 天津泰斯特儀器有限公司；Centrifuge 5810R離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；PYX-DHG-9023-A干燥箱 上海新諾儀器設(shè)備有限公司；TP650 PCR儀 日本TaKaRa公司；Pico17小型離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；DYY-10C電泳儀 北京百晶生物技術(shù)有限公司；GBOXHR凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)Syngene公司；溫控?fù)u床 德國(guó)Sartorius；YXQ-LS-75SII滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州凈化工程公司；移液槍 德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 貝酵母基因組DNA的獲取方式 為了保障所提取的DNA均為高品質(zhì),可選擇試劑盒進(jìn)行DNA提取實(shí)驗(yàn)操作。與此同時(shí),可選用瓊脂糖凝膠實(shí)施電泳檢測(cè)。

1.2.2 貝酵母ADR1基因的獲取方式 根據(jù)已公布的貝酵母基因組[22]數(shù)據(jù),利用Primer Primer3,確定上游引物

ADR1L1:5′-TCTTCTTGGACTGCCGCTAT-3′

ADR1L2:5′-ATCGAATGGCAACGAGAATC-3′

ADR1L3:5′-ATCGAATGGCAACGAGAATC-3′

及下游引物

ADR1R1:5′-GAAAGGCCAATTTCGTTTGA-3′

ADR1R2:5′-TGCACATGTTCCTCAATGGT-3′

ADR1R3:5′-GTGCACATGTTCCTCAATGG-3′

進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系參考賀笑[23]關(guān)于貝酵母FZF1基因的方法。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的程序?yàn)?在95 ℃的環(huán)境下預(yù)變性為5 min;同樣95 ℃溫度下變性時(shí)長(zhǎng)為30 s;退火溫度為58 ℃,時(shí)長(zhǎng)為30 s;延長(zhǎng)時(shí)間為60 s,溫度保持在72 ℃,循環(huán)三十五次;之后在72 ℃溫度節(jié)點(diǎn)延伸7 min;溫度4 ℃保存樣品。將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)物保存在-20 ℃的冰箱中。

1.2.3 貝酵母ADR1基因的序列測(cè)定和所翻譯蛋白的分析 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)物通過瓊脂凝膠的電泳測(cè)試之后,交由上海生工進(jìn)行ADR1貝酵母測(cè)序。借助ORF Finder工具對(duì)該測(cè)序并拼接出的核苷酸序列中存有的開放閱讀欄進(jìn)行查找。同時(shí)利用在線檢測(cè)工具分析這條核苷酸中翻譯的蛋白質(zhì),如基本的理化性質(zhì)(ProtParam)、親水性(ProtScale)、跨膜區(qū)(TMHMM)、信號(hào)肽(SignalP)、激酶磷酸化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)(KinasePhos)、Coil區(qū)分析(Coils Server)、亞細(xì)胞定位(TargetP和PSORT)和結(jié)構(gòu)域(SMART)方面的分析。最后預(yù)測(cè)該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(PredictProtein)以及其三級(jí)結(jié)構(gòu)(Swiss-Model)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ADR1基因擴(kuò)增結(jié)果和分析

ADR1基因經(jīng)過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增后,通過瓊脂糖凝膠電泳分離。得到圖1的凝膠圖后,通過與Marker的比對(duì)得出其大小在3000～4500 bp之間,與后期測(cè)序所得結(jié)果相符。

圖1 ADR1基因PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR determination of ADR1 gene 注:1為ADR1基因PCR;2為DNA ladder。

2.2 貝酵母ADR1基因編碼蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

Open Reading Frame Finder(https://www.ncbi. nlm.nih.gov/orffinder/)分析結(jié)果表明,該核苷酸序列含有一個(gè)長(zhǎng)3960 bp的開放閱讀框,可編碼1319個(gè)氨基酸。氨基酸序列,見圖2。

圖2 貝酵母ADR1編碼出的蛋白質(zhì)序列Fig.2 A sequence of protein encoded by S.bayanus ADR1 gene

2.2.1 探討貝酵母ADR1蛋白的理化性質(zhì) 使用ExPASy(http://us.expasy.org/tools/protparam.html)軟件分析該蛋白質(zhì),同時(shí)針對(duì)理化性和組成成分以進(jìn)行詳細(xì)分析。得出最終的蛋白質(zhì)分子式為:C6664H10376N1822O2072S53,分子質(zhì)量為150869.8,該蛋白質(zhì)的理論pI值為6.40,表1中描述了該氨基酸的構(gòu)成和各氨基酸的親疏水性。在該條氨基酸上,共計(jì)有亮氨酸有141個(gè),所占比例為10.7%,絲氨酸有147個(gè),所占比例為11.10%,與其它氨基酸相比,這兩者所占比例較高,該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為41.27,脂肪系數(shù)為77.92,總平均親水性為-0.529,因此判定其為不穩(wěn)定蛋白。

表1 貝酵母ADR1編碼出的蛋白質(zhì)中氨基酸的比例以及親疏水性的分值Table 1 The proportion of amino acids and hydrophobic value of the proteins encoded by ADR1 gene

采用ProtScale(http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)進(jìn)行蛋白質(zhì)的親水性分析。首先,可以從圖3中了解到,依照20種氨基酸疏水特性的資料,具有較低負(fù)值的氨基酸的親水性較強(qiáng),而正值較高的氨基酸有著較強(qiáng)的疏水性[24]。按照正負(fù)值比例推測(cè),該ADR1蛋白為親水蛋白。圖形所輸出該ADR1蛋白最高分值與最低分值分別為2.956、-2.844,可能存在跨膜區(qū)。在124、246、485、501、578、814、876氨基酸位點(diǎn)附近的分值分別是-2.844、-2.544、-2.633、-2.844、-2.433、-2.544、-2.344,上述位點(diǎn)具有高親水性,表明此區(qū)域可能存在折疊。

圖3 ADR1編碼蛋白質(zhì)的親水性Fig.3 The hydrophilicity of the protein encoded by the ADR1 gene

2.2.2 預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位與蛋白質(zhì)信號(hào)肽 SignalP 3.0 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析預(yù)測(cè)結(jié)果見圖4,不含有典型的信號(hào)肽區(qū)域。

圖4 貝酵母ADR1蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.4 Signal prediction by the ADR1 protein of S. bayanus

利用在線軟件Targetp(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)軟件進(jìn)行分析,分析該蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位情況,具體可以從表2查看。該蛋白質(zhì)具有0.054的可能性在線粒體內(nèi),有0.033的可能性在分泌通路內(nèi),同時(shí),其他位置的可能性是0.966。也就是說該蛋白質(zhì)可能存在于分泌通路以外或者線粒體以外的位置。從而證明,該蛋白質(zhì)有可能是一種在細(xì)胞核中進(jìn)行代謝調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子。

表2 貝酵母ADR1編碼的蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位情況Table 2 ADR1 encoded protein subcellular localization

2.2.3 激酶磷酸化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過KinasePhos(http://kinasephos2.mbc.nctu.edu.tw/index.html)在線分析工具來預(yù)測(cè)此蛋白質(zhì)的修飾激酶與磷酸化位點(diǎn),為了降低假陽(yáng)性率,一旦該蛋白質(zhì)的限定值超出百分之九十的范圍的時(shí)候,在線工具提交時(shí)要全部選擇這酪氨酸、蘇氨酸、絲氨酸和組氨酸四種蛋白質(zhì),具體預(yù)測(cè)情況如表3所示,潛在的磷酸化位點(diǎn):絲氨酸(S)激酶潛在位點(diǎn)為27個(gè)、蘇氨酸(T)激酶潛在位點(diǎn)為28個(gè)、酪氨酸(Y)激酶潛在位點(diǎn)為16個(gè)，可對(duì)修飾后的蛋白質(zhì)功能的進(jìn)行有極大促進(jìn)效用。

表3 貝酵母ADR1基因編碼出的蛋白質(zhì)激酶磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)情況Table 3 The prediction of protein kinase phosphorylation sites of ADR1

2.3 貝酵母ADR1基因編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3.1 Coil區(qū)分析 基于lupas的測(cè)算方式,采用Coils(http://www. ch. embnet. org/software/COILS_form. html)在線分析工具,進(jìn)行該蛋白質(zhì)的卷曲螺旋的預(yù)測(cè)操作。詳情可見圖5。

圖5 ADR1基因編碼蛋白質(zhì)的coil區(qū)分析圖Fig.5 ADR1 gene encoding protein coil region analysis

這組蛋白質(zhì)殘基共包含Window 14、21、28三個(gè)不同的窗口,每一個(gè)窗口都可顯示其卷曲螺旋的具體位置,但是文本數(shù)據(jù)并沒有羅列。第一個(gè)卷曲螺旋序列位于18～43區(qū)域框內(nèi)。

2.3.2 蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過TMPRED、TMHMM在線軟件分別分析了研究該組蛋白質(zhì)跨膜螺旋區(qū),分析結(jié)查中均出現(xiàn)兩個(gè)可能的跨膜螺旋區(qū),此蛋白為典型的跨膜蛋白。通常蛋白質(zhì)含有跨膜區(qū),即可能作為膜受體、錨定蛋白或離子通道蛋白,均不溶于水,所以該預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)為水溶性蛋白。這與蛋白質(zhì)的親疏水性性質(zhì)一致。TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)結(jié)果見圖6。

圖6 ADR1基因編碼蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)分析圖Fig.6 Transmembrane region analysis of ADR1 encoding proteins

借助預(yù)測(cè)的網(wǎng)站Predict Protein(http://www.predictprotein.org/)進(jìn)行這組蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果表明該ADR1的二級(jí)結(jié)構(gòu)中環(huán)占比65.72%,螺旋占比33.07%,折疊僅占比1.10%。

2.4 貝酵母ADR1基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域分析

借助Smart(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線服務(wù)器對(duì)ADR1蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行研究,詳情如圖7所示。該氨基酸序列之中,排在第106～126之間,第134～155位氨基酸位點(diǎn)出分別存在一個(gè)C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域。二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)表明螺旋(Helix)的比例為33.07%,可能是鋅指結(jié)構(gòu)的重要組成部分。

圖7 分析ADR1編碼出的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域Fig.7 The structure domain analysis of protein encoded by ADR1 gene

采取prosite數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.expasy.org/prosite)對(duì)這組蛋白質(zhì)作出motif查詢。詳細(xì)信息見圖8所示。其中“標(biāo)尺”顯示結(jié)構(gòu)域的位置。這組蛋白質(zhì)中,有兩個(gè)地方和指定模板匹配,具體位置在第106～126位以及134～155位。都分別存在一個(gè)鋅結(jié)構(gòu)域。這種描述與之前提及的smart在線查詢出的果一致?？梢酝茰y(cè)ADR1基因編碼的蛋白很有可能是通過這2個(gè)C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域結(jié)合ADH2基因特異性,以此提升ADH2基因的表達(dá),來提高貝酵母的酒精代謝能力。

圖8 ADR1基因編碼蛋白質(zhì)的motif分析Fig.8 Motif analysis of protein encoded by ADR1 gene

2.5 貝酵母ADR1基因編碼蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

預(yù)測(cè)貝酵母ADR1基因編碼的蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu),使用SWISS-MODEL(http://swissmodel. expasy. org/)在線預(yù)測(cè)軟件,如圖9所示，本文中的蛋白是基于Aart原子結(jié)構(gòu)2i13.2的C鏈進(jìn)行同源建模的,兩者的序列一致性可以達(dá)到30.69%,GMQE值為0.03,GMQEAN值達(dá)到了-3.81,這些評(píng)分說明建模質(zhì)量較好。此圖清晰地表明該蛋白擁有跨膜區(qū),是由主要是由卷曲和折疊加上少量螺旋所組成的,和二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)相符。分析結(jié)果可以得出預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)也擁有2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域,這和二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)相同。

圖9 ADR1基因編碼蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)圖Fig.9 Tertiary structure prediction of protein encoded by ADR1 gene

2.6 ADR1序列比對(duì)分析

利用NCBI網(wǎng)站上的Blast工具對(duì)貝酵母ADR1基因進(jìn)行同源檢索,選取相似性大于78%部分菌株的ADR1 基因進(jìn)行序列全長(zhǎng)分析,通過檢索對(duì)比發(fā)現(xiàn),該基因與真貝酵母(S.eubayanus)ADR1基因同源性高達(dá)92%,與黃酒酵母(Saccharomycesarboricola)的ADR1基因?yàn)?1%,與釀酒酵母YJM1402、YJM1273、R103、S288c、JAY291、P301等48個(gè)菌株的同源性為79%。較高的同源性說明該ADR1基因編碼的蛋白質(zhì)功能與酵母執(zhí)行乙醇代謝的ADR1功能很相似,即有可能有調(diào)控乙醇脫氫酶的功能。

3 結(jié)論與討論

本研究首次對(duì)貝酵母ADR1基因進(jìn)行了克隆分析,從數(shù)據(jù)反饋可以知道,該核酸序列能夠編碼成一條有1319個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),分子式為C6664H10376N1822O2072S53,結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,屬于親水性蛋白,含兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,在細(xì)胞核中亞細(xì)胞可發(fā)揮其的效用。除此之外,還包含C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域,環(huán)結(jié)構(gòu)比例排在首位的二級(jí)結(jié)構(gòu)形態(tài)。預(yù)測(cè)它的三級(jí)結(jié)構(gòu)也大致和二級(jí)結(jié)構(gòu)相符。Hartshorne[25]和Blumberg[26]證明酵母ADR1基因有兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的特征,而且必須擁有兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)才能正常執(zhí)行ADR1基因的功能,本文通過結(jié)構(gòu)域分析得出貝酵母ADR1基因含有兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域和前人的研究相符,提升了我們結(jié)論的可靠性和對(duì)貝酵母功能推斷的準(zhǔn)確性。

釀酒酵母ADR1基因編碼的蛋白質(zhì)和貝酵母ADR1的基因編碼蛋白質(zhì)的性質(zhì)基本一致。Denis和Young等[13,27-30]的研究表明釀酒酵母中ADR1基因是醇脫氫酶相關(guān)的乙醇代謝正向調(diào)節(jié)基因,也是釀酒酵母生長(zhǎng)所必需的調(diào)控基因。實(shí)際上釀酒酵母ADR1基因所編碼的蛋白質(zhì)屬于典型的親水性蛋白,內(nèi)里含有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,對(duì)細(xì)胞核活動(dòng)會(huì)起到一定的影響。該蛋白質(zhì)中的氨基酸序列有4處的coil區(qū)和兩處跨膜區(qū),ADR1基因所編碼的蛋白質(zhì)中含有兩個(gè)C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域,而鋅指結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合及基因調(diào)控有關(guān)。本研究結(jié)果與釀酒酵母ADR1基因的功能基本相符。當(dāng)然,本文所推測(cè)的結(jié)論還需要后續(xù)進(jìn)行功能確證等進(jìn)一步驗(yàn)證。

從近年來國(guó)內(nèi)外對(duì)植物或動(dòng)物基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析的研究[31-34]不難發(fā)現(xiàn)在對(duì)生物基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析時(shí),DNA序列比對(duì)法多用于比較蛋白序列,進(jìn)而判定親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近,使結(jié)構(gòu)和功能的分析、預(yù)測(cè)使研究更精確、全面和深入。本實(shí)驗(yàn)研究采用序列比對(duì)分析、結(jié)構(gòu)比對(duì)分析和功能比對(duì)分析三種方法綜合分析,首先對(duì)貝酵母ADR1基因進(jìn)行測(cè)序,以得到其核苷酸序列,同時(shí)還要分析這組序列中的蛋白質(zhì),然后利用在線分析工具,了解該蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)、跨膜區(qū)、coil區(qū)、亞細(xì)胞定位等。并且對(duì)該組蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。因此,結(jié)果比較可靠。此外,本研究由蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)預(yù)測(cè)和推斷其所行使的功能,以及如何影響細(xì)胞生長(zhǎng)及代謝,為進(jìn)一步研究貝酵母乙醇代謝的詳細(xì)過程和途徑奠定了一定的基礎(chǔ)。

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