王艷瑛，魯曉娟

(駐馬店市中心醫(yī)院普外二科，河南 駐馬店 463000)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是肝臟疾病主要病因之一。HBV感染呈全球分布，與肝硬化及肝癌的關(guān)系密切，是世界范圍內(nèi)重要的公共健康問題，全球人口的30%有血清學(xué)證據(jù)證實(shí)現(xiàn)癥或既往感染HBV[1]。micro RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼RNA，它參與癌癥發(fā)生發(fā)展過程中多個(gè)通路的調(diào)控[2]。研究表明，mi RNA-122在HBV感染中起著重要的抑制作用，它可能成為新的HBV感染診斷和預(yù)后的重要生物標(biāo)記以及治療靶點(diǎn)[3]。 此外，一些細(xì)胞因子（IL-2，IL-4）等在慢性乙型肝炎發(fā)病機(jī)制及治療中的作用研究越來越受到人們的關(guān)注[4]。本研究探討乙型肝炎病毒（HBV）感染患者血清白細(xì)胞介素-12（IL-12）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）及miRNA-122的水平變化及其意義，報(bào)告如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取醫(yī)院確診的HBV感染患者126例（HBV組），另外選取健康體檢對象40例作為對照組，收集時(shí)間2014年1月至2017年1月。HBV組，男 62例、女 64例，年齡 28～75歲，平均49.6±18.7歲，其中慢性HBV攜帶者39例、慢性乙型肝炎患者54例、乙型肝炎肝硬化患者33例。對照組，男22例、女18例，年齡22～79歲，平均46.7±15.9歲。兩組患者的年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ⑴HBV感染的診斷及患者分組標(biāo)準(zhǔn)參考2010年《慢性乙型肝炎防治指南診斷標(biāo)準(zhǔn)》；⑵患者年齡范圍19～79歲；⑶對照組來源于本院體檢健康的自愿者；⑷本研究獲得研究對象的知情同意。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ⑴肝臟腫瘤；⑵合并其他類型肝炎病毒感染；⑶HIV感染；⑷經(jīng)過抗病毒治療。

1.3 miRNA-122檢測 抽取外周靜脈血2ml，置于EDTA抗凝管中，采用Trizol試劑盒（購自美國Invitrogen公司）提取血清總RNA，方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。Nanodrop2000型核酸測定儀上測定RNA濃度，選取U6作為內(nèi)參基因，以cDNA為模板，采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒（大連Takara公司）檢測血清miRNA-122水平。

1.4 IL-12、IL-4 患者于早上8點(diǎn)空腹采血5ml，3000r/min進(jìn)行離心后提取上清，將上清液在-20℃的環(huán)境中保存，IL-12、IL-4使用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測，檢測試劑盒由上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司提供，酶標(biāo)儀選用Synergy H1全功能酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）。

1.5 HBeAg、HBV-DNA、ALT檢測 血清ALT用日本東芝TBA-2000FR全自動(dòng)生化分析儀和配套試劑進(jìn)行檢測，測定方法為酶速率法。HBV-DNA采用LightCycler熒光PCR檢測儀，試劑盒為中山大學(xué)達(dá)安基因公司乙肝病毒(HBV)核酸擴(kuò)增熒光檢測試劑盒，操作按照說明書進(jìn)行。采用乙型肝炎診斷試劑盒進(jìn)行乙肝病毒感染標(biāo)志物HBeAg檢測。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS 16.0，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，組間比較采用單因素方差分析法，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析法采用Pearson線性相關(guān)分析法；P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組的血清IL-12、IL-4及miRNA-122水平比較 慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者的血清IL-12、miRNA-122水平均顯著的高于對照組（P＜0.05），慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者與對照組的血清IL-4水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），慢性HBV攜帶者的血清IL-12、miRNA-122顯著高于慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者（P＜0.05）（表 1）。

2.2 各組的HBeAg、HBV-DNA、ALT水平比較 慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者的HBeAg、lg HBVlog10HBV-DNA水平均顯著的高于對照組（P＜0.05），慢性乙型肝炎患者的HBeAg、ALT水平顯著的高于慢性HBV攜帶者、乙型肝炎肝硬化患者（P＜0.05）（表 2）。

2.3 相關(guān)性分析 HBV感染患者IL-12、miRNA-122 與 HBeAg、lg log10 HBV-DNA、ALT 呈顯著的正相關(guān)性（P＜0.05），IL-4 與 HBeAg、lg log10 HBVDNA、ALT 無明顯的相關(guān)性（P＞0.05）（表 3）。

表1 各組的血清IL-12、IL-4及miRNA-122水平比較（x±s）

表2 各組的 HBeAg、HBV-DNA、ALT 水平比較（x±s）

表3 相關(guān)性分析

3 討論

乙型肝炎病毒(HBV）簡稱乙肝病毒，是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科[5]。近年來，乙型肝炎病毒 （HBV）感染是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，在我國尤為突出。慢性HBV感染者可以劃分為慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化、慢性HBV攜帶者及隱匿性慢性乙型肝炎[6]。目前，我國乙型肝炎的病原學(xué)診斷主要依據(jù)血清HBV感染標(biāo)記物的檢測結(jié)果，主要反映人體對乙肝病毒的免疫反應(yīng)狀態(tài)。但這種方法的缺點(diǎn)是血清HBV感染標(biāo)記物組合模式較多，使結(jié)果難以判定，因此尋找可靠的檢測指標(biāo)十分重要。

機(jī)體被HBV感染后，引起特異性免疫反應(yīng)，促進(jìn)疾病恢復(fù)。機(jī)體主要通過T淋巴細(xì)胞清除入侵的HBV病毒，T細(xì)胞既可以作為免疫效應(yīng)細(xì)胞直接殺傷靶細(xì)胞，又可以作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[7]。有研究報(bào)道稱，Th1/Th2細(xì)胞的比例失調(diào)可能是HBV感染慢性化的原因之一。白細(xì)胞介素-12（interleukin-12，IL-12）是由多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生并作用于多種細(xì)胞的一類細(xì)胞因子，由Th1細(xì)胞分泌。IL-12可刺激活化型T細(xì)胞增殖，促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，在抗腫瘤免疫及抗感染免疫中被人們寄予厚望[8]。本研究結(jié)果顯示，慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者的血清IL-12水平均顯著的高于對照組 （P＜0.05），而且慢性HBV攜帶者的血清IL-12顯著的高于慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者（P＜0.05）；表明HBV感染患者的IL-12水平較健康人群顯著的增高，并且與患者肝功能、病毒復(fù)制、傳染性具有一定的關(guān)系。白細(xì)胞介素4（interleukin 4，IL-4)是Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)體液免疫和適應(yīng)性免疫中起關(guān)鍵作用。Lu Y等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在慢性乙型肝炎中，IL-4升高，體液免疫增強(qiáng)，與HBV持續(xù)感染有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者與對照組的血清IL-4水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可能與HBV感染未能明顯影響Th2細(xì)胞合成和分泌IL-4有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

micro RNA（mi RNA)是長度約 22 nt的內(nèi)源性短鏈RNA，在體內(nèi)可以通過促進(jìn)靶向基因mRNA的降解，或抑制mRNA翻譯，從而導(dǎo)致靶基因水平下降。研究表明，miRNA參與多種腫瘤細(xì)胞的活動(dòng)，在多種腫瘤中異常表達(dá)[10]。腫瘤組織中往往存在特異性miRNA表達(dá)量的變化。miRNA在肝癌組織中低表達(dá)，但在肝癌患者血清中含量則升高，其表達(dá)水平和預(yù)后有密切關(guān)系[11]。microRNA-122是肝臟的特異性 (miRNA)，占全部肝內(nèi)miRNA的70%，研究表明miRNA-122能調(diào)控HBV的復(fù)制[12]。以往研究顯示，慢性乙肝病毒引起肝臟損傷會導(dǎo)致到miRNA-122的升高[13]。但是較少有研究指出其與患者肝功能之間的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者的血清miRNA-122水平均顯著的高于對照組 （P＜0.05），這與國內(nèi)外研究結(jié)果相符合[14，15]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，慢性HBV攜帶者的血清miRNA-122顯著的高于慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者（P＜0.05）；而慢性乙型肝炎患者的HBeAg、ALT水平顯著的高于慢性HBV攜帶者、乙型肝炎肝硬化患者 （P＜0.05）。說明血清miRNA-122的表達(dá)水平與肝臟損傷程度呈負(fù)相關(guān)，因此miRNA-122的表達(dá)水平有可能成為監(jiān)控慢性HBV感染的血清學(xué)指標(biāo)。

綜上所述，HBV感染患者的miRNA-122、IL-12水平較健康人群顯著的增高，并且與患者肝功能、病毒復(fù)制、傳染性具有一定的關(guān)系，因此miRNA-122、IL-12在HBV感染患者血清中的表達(dá)情況，對該病的早期診斷、治療和預(yù)后評估可能有重要意義，需進(jìn)一步研究闡明其具體功能。

[1]劉再伏，胡光元，何啟俊.乙型肝炎病毒含量及感染方式與臨床治愈率相關(guān)性研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2015，25(3)：562-563.

[2]謝震宇，傅益飛，張愛華，等.乙型肝炎病毒變異在母嬰傳播中的初步研究[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36(7)：715-721.

[3]李曼，孫學(xué)華，周振華，等.慢性乙型肝炎病毒感染者外周血T細(xì)胞γ干擾素和白細(xì)胞介素4的水平變化[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2016，32(2)：240-244.

[4]張凱，劉小靜，藺淑梅.乙型肝炎病毒相關(guān)肝細(xì)胞癌抗病毒治療的作用及對預(yù)后的影響 [J].中國實(shí)用內(nèi)科雜志，2015，35(6)：495-498.

[5]赫曉林，黃建煒，許瑞安，等.HBV病毒復(fù)制機(jī)制及慢性乙型肝炎藥物靶點(diǎn)[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2015，31(2)：152-156.

[6]梁金明，陳聰，歐志蓮，等.乙型肝炎病毒標(biāo)志物檢測方法的選擇與應(yīng)用[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2016，34(5)：568-570.

[7]Liu L，Xu Y，Liu Z，et al.IL12 polymorphisms，HBV infection and risk of hepatocellular carcinoma in a high-risk Chinese population.[J].J GASTROENTEROL Journal of Gastroenterology，2011，128(7)：1692.

[8]Crett陶鵬輝.乙型肝炎病毒感染者血清HBV DNA與IL-21及IFN-γ 水平的相關(guān)性[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2017，35(3)：347-350.[9]Lu Y，Wu Z，Peng Q，et al.Role of IL-4 gene polymorphisms in HBV-related hepatocellular carcinoma in a Chinese population[J].PLOS ONEPlos One，2014，9(10)：e110061.

[10]Li Z，Guo Y，Zhou L，et al.Association of a functional RAD52 genetic variant locating in a miRNA binding site with risk of HBV-related hepatocellular carcinoma[J].Mol Carcinai，2015，54(9)：853-858.

[11]郝美君，鄭素軍，丁惠國，等.MicroRNA-122作用于HBx影響乙肝病毒復(fù)制[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2011，28(4)：784-789.

[12]Zheng QF，Zhang JY，Wu JS，et al.Upregulation of miRNA-130a Represents Good Prognosis in Patients With HBV-Related Acuteon-Chronic Liver Failure：A Prospective Study[J].Medicine，2016，95(6)：e2639.

[13]Qiu L，F(xiàn)an H，Jin W，et al.miR-122-induced down-regulation of HO-1 negatively affects miR-122-mediated suppression of HBV.[J].Biochem Biophys Res Commun，2010，398(4)：771-777.

[14]Feng P，Xiao X，Jiang Y，et al.HBx Down-Regulated Gld2 Plays a Critical Role in HBV-Related Dysregulation of miR-122[J].Plos One，2014，9(3)：e92998.

[15]Luna JM，Michailidis E，Rice CM.Mopping up miRNA：An integrated HBV transcript disrupts liver homeostasis by sequestering miR-122[J].J Hepatol，2016，64(2)：257.