董桂香，王愛國，王雷鳴

(鄭州市骨科醫(yī)院，河南 鄭州 450052)

肌酸激酶是人體生物體內(nèi)能量代謝的關(guān)鍵酶，在生物體內(nèi)一些關(guān)鍵耗能的細胞和組織中均存在分布，肌酸激酶的四種同工酶主要以二聚體形式存在，且腦型肌酸激酶在許多疾病診斷中得到廣泛使用[1，2]。人體基因組中由于單個核苷酸發(fā)生變化，導(dǎo)致DNA序列產(chǎn)生多樣性，臨床將其稱為單核苷酸多態(tài)性（SNP）[3，4]。 SNP 在人體中含量相對較高，并且分布較廣，具有一定的遺傳性，并且其表達水平與人腦肌酸激酶活性有關(guān)，能在一定程度上影響人腦型肌酸激酶結(jié)構(gòu)、功能等，誘導(dǎo)期能力代謝異常[5，6]。本研究旨在探討人腦型肌酸激酶SNP突變體二體解離與活性的關(guān)系，現(xiàn)將研究結(jié)果簡要報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年12月-2016年12月醫(yī)院采集有人腦部組織的患者50例，男28例，女22 例，年齡 38～62 歲，平均（45.64±4.53）歲。疾病類型：24例腦梗死，16例腦出血，10例顱腦外傷。入選患者均符合1996年全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會議中關(guān)于腦血管疾病臨床診斷標準[7]，均經(jīng)過生化指標、頭顱CT檢查或MRI得到確診。不同患者性別、年齡、疾病類型比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 方法 ⑴測定原理。采用pH-比色法測定標本組織中肌酸激酶的活性，并對肌酸激酶的底物進行反應(yīng)動力學(xué)試驗。肌酸激酶在催化正向反應(yīng)時會隨著ATP向肌酸上轉(zhuǎn)移磷酰基的同時產(chǎn)生相同摩爾的氫離子，其最適宜的pH為7.5～9.0，屬于一個寬闊的平臺狀。在該范圍內(nèi)測定氫離子的生成速度可以作為酶活力的測定指標。⑵腦型肌酸激酶SNP突變體的裂解與分離：取獲得的人腦部組織，加入5mmol/L乙醇，保證溶液PH值為7.5，加入50mmol/L Tris-HCL液支撐勻漿，15min離心，速度為31000r/min，去除沉淀，獲得上層清液I；在磁力攪拌下緩慢加入預(yù)冷的濃度為95.0%乙醇，保證溶液溶度為50.0%，繼續(xù)攪拌30min，15min離心，獲得上層清液Ⅱ。再加入乙醇提高藥物濃度為70.0%，15min離心，速度為3400r/min，去除上層清液Ⅲ，將獲得的沉淀中加入Tris攪拌后均勻，15min離心，速度為31000r/min，獲得上層清液Ⅳ，Tris透析1h后行Q-Sephsrose HP柱層析，控制流速為0.7ml/min。樣品上柱后，利用Tris洗滌，然后再用含0-500mmol/L NaCl的Tris液進行梯度洗脫，分別合并CK-BB和NSE峰值管，放置在Tris液中進行24h透析，-80℃下貯存，完成腦型肌酸激酶SNP突變體的裂解與分離。由SDS-PAGE與native-PAGE檢測均為一條帶。⑶檢測方法。采用280nm光吸收完成酶濃度的監(jiān)測，人腦部組織消光系數(shù)為8.8。根據(jù)文獻[8]方法進行，測定體系中含有底物肌酸與ATP及鎂離子，利用百里酚藍作為pH指示劑，利用pH比色法測定酶的活性[9，10]。結(jié)締組織與神經(jīng)組織后加入150ml濃度為0.01mol/L的KCl，利用組織打碎機、高速分散器進行3次粉碎，每次不超過30s，冰浴下離心15min，速度為8000r/min，取沉淀進行干燥，最終獲得人腦型肌酸激酶樣品。取樣作SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，測量其亞基分子量，檢測其是否達到電泳一條帶的純度，再次取樣采用凝膠層析法測量該酶的分子量[11，12]。

1.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS 18.0軟件處理，計數(shù)資料行x檢驗，采用n（%）表示，計量資料行t檢驗，采用（x±s）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人腦型肌酸激酶SNP突變體二體解離活性分析 人腦型肌酸激酶SNP突變體二體解離體對于酶的抑制反應(yīng)是不可逆的反應(yīng)。從圖1中可以看出產(chǎn)物濃度的對數(shù)與時間的變化為線性關(guān)系。通過曲線的斜率與抑制劑的濃度結(jié)果顯示：A值與SNP突變體二體解離存在正相關(guān)關(guān)系，見圖1。

圖1 人腦型肌酸激酶SNP突變體二體解離活性分析（圖中1、2、3、4、5表示連續(xù)測定的5個數(shù)據(jù)點）。

2.2 不同氨基酸位點對人腦型肌酸激酶活性的影響 本課題研究了26、36、59級267位氨基酸發(fā)生突變的人腦型肌酸激酶SNP突變體活性與二體穩(wěn)定性的關(guān)系，結(jié)果顯示：H26Y、P36T和T59I氨基酸更加容易發(fā)生解離，二體的解離與酶功能喪失成正相關(guān)性。由于空間排阻效應(yīng)影響二體形成蛋白質(zhì)的折疊途徑，導(dǎo)致SNP突變及動力學(xué)差異顯著（P<0.05），見表 1。

表1 不同氨基酸位點對人腦型肌酸激酶活性的影響

3 討論

肌酸激酶在人體腦部組織中含量豐富，不僅存在于星形細胞中，也存在于神經(jīng)元中，如神經(jīng)元軸突、樹突、子宮及甲狀腺中，但是這些組織中的肌酸激酶遠遠低于人腦組織中[13]。因此，臨床上將肌酸激酶用于臨床疾病診斷中效果理想，且診斷具有特異性[14]。通常來說，人腦型肌酸激酶水平的升高提示腦部損傷，且從功能可以分為四種：肌肉型、腦型、雜化型和線粒體型。有報道顯示[15]，細胞內(nèi)約有1%的氧被用于氧化細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，并且在衰老動物細胞中氧化的蛋白質(zhì)能占總蛋白質(zhì)的30.0%～50.0%，并且氧化過程中伴有蛋白質(zhì)的交聯(lián)、多肽鏈的斷裂、不同氨基酸的轉(zhuǎn)化以及氨基酸殘基的修飾。由此看出：人腦型肌酸激酶在人體中蛋白的合成、分解中發(fā)揮了重要的作用。本研究中，人腦型肌酸激酶SNP突變體二體解離體對于酶的抑制反應(yīng)是不可逆的反應(yīng)。從圖1中可以看出，產(chǎn)物濃度的對數(shù)與時間的變化為線性關(guān)系。通過曲線的斜率能獲得與抑制劑的濃度獲得A，結(jié)果顯示：A值與SNP突變體二體解離存在正相關(guān)關(guān)系。由此看出：人腦型肌酸激酶SNP突變體二聚體解離與活性之間存在一定的相關(guān)性。同時，人腦型肌酸激酶SNP突變后將會產(chǎn)生可逆的氧化狀態(tài)，并且這種修飾能引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，并且如果得不到及時有效的控制，又會引起進一步氧化或其他類型的修飾產(chǎn)生[16]。

本課題研究了26、36、59級267位氨基酸發(fā)生突變的人腦型肌酸激酶SNP突變體活性與二體穩(wěn)定性的關(guān)系，結(jié)果顯示：H26Y、P36T和T59I氨基酸更加容易發(fā)生解離，二體的解離與酶功能喪失呈正相關(guān)性。由于空間排阻效應(yīng)影響二體形成蛋白質(zhì)的折疊途徑，導(dǎo)致SNP突變及動力學(xué)差異顯著（P<0.05）。由此看出：人腦型肌酸激酶SNP突變體二聚體解離與活性之間存在明顯的相關(guān)性，通過測定人腦型肌酸激酶水平能了解患者的病情，指導(dǎo)臨床治療，使得患者的治療更具針對性[17]。

但是，本課題研究過程中尚存在很多不足，一方面標本在測定時存在過多的累積誤差，另一方面本研究屬于是一個全新的領(lǐng)域，研究過程中存在的難度相對較大，對于試驗結(jié)果的準確性及可靠性有待進一步研究和探討。綜上所述，人腦型肌酸激酶SNP突變體二聚體解離與活性間存在一定的相關(guān)性，用于一些疾病診斷中效果理想，為臨床治療提供依據(jù)和參考。

[1]宋青山，楊江流，賈芳.海藻糖對人腦型肌酸激酶熱變性的保護作用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2016，43（1）：157-163.

[2]孫妍妍，曲高平，黃謙心，等.甘藍型油菜抗苯磺隆突變體ALS基因分析與 SNP標記[J].中國油料作物學(xué)報，2015，37（5）：589-595.

[3]孔慶輝，晁燕，夏明哲，等.黃河裸裂尻魚肌酸激酶M-CKcDNA的克隆及組織表達分析[J].動物學(xué)雜志，2016，51（1）：84-94.

[4]肖雄，董占飛，古力努爾·哈布哈吉力，等.分化型甲狀腺癌患者術(shù)后停藥隨訪期間肌酸激酶水平升高的影響因素研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19（23）：2789-2793.

[5]呂和平，倪海真，黃景勇，等.肌酸激酶及CT血管造影檢查評估腸系膜上動脈栓塞的短期預(yù)后[J].中華消化外科雜志，2016，15（8）：840-844.

[6]王國慶.大鼠運動性骨骼肌損傷后血清肌酸激酶、乳酸脫氫酶以及波形蛋白的變化 [J].中國老年學(xué)雜志，2016，36（15）：3634-3636.

[7]楊小二，俞菁，胡荷宇，等.肌酸磷酸激酶檢測聯(lián)合分子診斷技術(shù)篩查新生兒杜氏肌營養(yǎng)不良癥[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2015，38（1）：32-34.

[8]李穎娜，宋翔，吳芳，等.肌酸激酶與CT冠狀動脈造影下支架通暢情況的相關(guān)性 [J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，2015，37（2）：140-146.

[9]張春，何娟，朱崢，等.丙泊酚鎮(zhèn)靜致肌酸激酶升高的病例分析[J].中國藥房，2015，26（12）：1651-1653.

[10]唐慎華，賈秀紅，李建廠，等.N末端B型鈉尿肽原和肌酸激酶同工酶MB對肺炎患兒心力衰竭的診斷價值[J].臨床兒科雜志，2015，33（8）：694-697.

[11]張齡幻，于艷輝，朱曉萍.重癥肺炎合并心力衰竭患兒血清肌酸激酶同工酶、腦利鈉肽及神經(jīng)肽Y水平變化[J].臨床兒科雜志，2015，33（6）：539-542.

[12]胡茂龍，龍衛(wèi)華，高建芹，等．油菜抗咪唑啉酮類除草劑基因BnALS1R等位基因特異PCR標記的開發(fā)與應(yīng)用[J].作物學(xué)報，2013，39（10）：1711－1719．

[13]Hu ML，Pu HM，Kong LN，et al．Molecular characterization and detection of a spontaneous mutation conferring imidazolinone resistance in rapeseed and its application in hybrid rapeseed production[J].Mol Breeding，2015，35（31）：1-13．

[14]Li HT，Li JJ，Zhao B，et al．Generation and characterization of tribenuron-methyl herbicide-resistant rapeseed（Brasscia napus）for hybrid seed production using chemically induced male sterility[J].Theor Appl Genet，2015，128（1）：107-118．

[15]Ghio C，Ramos ML，Altieri E，et al．Molecular characterization of ALS1，an acetohydroxyacid synthase mutation conferring resistance to sulfonylurea herbicides in soybean [J].Theor Appl Genet，2013，126（38）：2957-2968．

[16]劉首明，夏慧，江小萍，等.急性心肌梗死患者心型脂肪酸結(jié)合蛋白水平檢測及臨床價值 [J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2015，33（5）：673-675.

[17]胡娟玉，李禮.心型脂肪酸結(jié)合蛋白與肌紅蛋白聯(lián)合檢測在急性心肌梗死早期診斷中的價值 [J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2014，32（3）：297-306.