崔 勇， 朱風(fēng)華， 陳 甫， 李 玲， 鞏青軍， 張艷玲， 朱連勤

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院， 山東 青島 266109 ；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院， 山東 青島 266109 ；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 山東 青島 266109)

銅是家禽必需的微量元素之一，硫酸銅等銅源飼料添加劑生物利用率低，易隨糞便排出造成銅污染。 因此，國內(nèi)外學(xué)者以提高日糧銅吸收率、降低飼料添加量、減少環(huán)境污染為目標(biāo)，不斷探尋新的銅源化合物。 Peralta -Videa[1]等指出，當(dāng)微小粒子進入納米量級(1 nm ～100 nm)時，其本身具有量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)和量子隧道效應(yīng)，導(dǎo)致納米體系的光、熱、電、磁等的物理性質(zhì)出現(xiàn)許多新奇特性。 有研究表明，飼料中添加納米氧化銅的生物吸收率與利用率高于硫酸銅和氧化銅，可減少飼料中Cu 添加量，并間接減少糞便中Cu 的排放量[2]。 本課題組前期研究表明，在飼料中添加高水平鋅，雛雞沒有拮抗納米氧化銅的吸收，沒有呈現(xiàn)高鋅對銅吸收利用的拮抗效應(yīng)，這一定程度上說明了納米氧化銅在機體的吸收轉(zhuǎn)運機制可能異于常規(guī)銅源添加劑[3]。 進一步研究發(fā)現(xiàn)，在Caco-2 細(xì)胞模型上，納米氧化銅的表觀滲透系數(shù)、轉(zhuǎn)運量和轉(zhuǎn)運率高于硫酸銅和微米氧化銅，說明納米氧化銅與硫酸銅、微米氧化銅的吸收機制不同，納米氧化銅可能以銅離子和納米粒子兩種形式被機體吸收利用[4]。 本試驗旨在研究硫酸銅、微米氧化銅及納米氧化銅在雞腺胃吸收藥物代謝動力學(xué)和納米氧化銅在雞腺胃、肝臟的分布，從器官和細(xì)胞水平揭示納米氧化銅在腺胃的吸收轉(zhuǎn)運機制，為納米氧化銅作為新型銅源添加劑在畜禽養(yǎng)殖上的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 JEM -2100F 型200 kV 場發(fā)射透射電子顯微鏡(JEOL，日本)；X -MaxN 80T 型能譜儀探頭(Oxford，英國)；7700X 型電感耦合等離子體光學(xué)發(fā)射光譜儀(GE，美國)；EM-UC7 型超薄切片機(Leica，德國)；AR224CN 型電子天平(OHAUS，美國)；MQ -gard 型超純水系統(tǒng)(MILLIPOR，美國)；MX-F 型固定式混勻儀(DRAGONLAB，美國)。

硫酸銅、微米氧化銅、納米氧化銅(球形，粒徑＜50 nm)(Sigma，美國)；1x 磷酸鹽緩沖液(pH 值7.2 ～7.4，索萊寶，北京)；銅標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL，國家有色金屬及電子材料分析測試中心)；濃硝酸(GR)、高氯酸(GR)、乙醚均為國產(chǎn)試劑。

1.2 實驗動物及處理 選20 只8 周齡健康海藍(lán)褐殼雛雞隨機分為4 組。 第1 組空白對照組。 第2 ～4 組為試驗組，分別以硫酸銅、微米氧化銅(混懸液)、納米氧化銅(混懸液)形式向腺胃內(nèi)注入銅100 mg/kg·bw。 對照組注射生理鹽水。 給藥前24 h禁食，自由飲水。 將受試雞用乙醚麻醉，通過微創(chuàng)外科手術(shù)將十二指腸與肌胃交界處結(jié)扎。 之后將嗉囊與下段食管交界處結(jié)扎，完成注射后，縫合皮膚。

1.3 飼料及飼養(yǎng)管理 4 周齡雛雞自由采食低銅玉米豆粕型日糧，飼料配方與營養(yǎng)成分見表1，連續(xù)28 d。 自由飲用去離子水。 按常規(guī)飼養(yǎng)管理。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)成分(風(fēng)干基礎(chǔ))/%

1.4 樣品的采集與制備 給藥前和給藥后第1、2、4、6、8、12、24、36 小時，從所有雞的翅下靜脈采血2 mL，肝素鈉抗凝。 每次采血前均采用毛細(xì)管法監(jiān)控紅細(xì)胞壓積(PCV)。 最后1 次采血結(jié)束后，立即剖殺所有受試雞，在剖殺后2 min 內(nèi)取納米氧化銅組雞腺胃與肝臟小塊組織，在0 ℃條件下，浸潤在0.1 mol/L PBS 中迅速切割成1 mm3大小的組織塊，轉(zhuǎn)移至0.1 mol/L 的磷酸鹽戊二醛固定液中前固定，4 ℃條件下過夜，以備制作TEM 超薄切片。 將所有剩下的靶器官用超純水沖洗表面，置于75 ℃鼓風(fēng)干燥箱風(fēng)干72 h。 器官烘干后稱重，研磨成粉末狀。

1.5 檢測指標(biāo)與方法

1.5.1 全血中銅含量的測定 吸取1 mL 全血，放于50 mL 錐形瓶中，加入混合酸15 mL(濃硝酸和高氯酸配比3∶1)，小心煮沸至0.5 mL 澄清溶液，冷卻后加5 mL 超純水以清洗錐形瓶內(nèi)壁，然后加熱至溶液再剩0.5 mL 左右，冷卻后轉(zhuǎn)入10 mL 容量瓶，用超純水定容。 處理好的樣品用ICP -OES 測定樣品中的銅含量。

1.5.2 腺胃和肝臟中銅含量的測定 分別準(zhǔn)確稱取約0.1 g 腺胃和約0.5 g 肝臟(風(fēng)干樣，精確至0.000 1 g)，置于50 mL 錐形瓶中，加入混合酸15 mL，先以120 ℃加熱30 min 至器官泡沫消解后，加溫小心煮沸至0.5 mL 澄清溶液，冷卻后加5 mL超純水以清洗錐形瓶內(nèi)壁，然后加熱至溶液再剩0.5 mL 左右，冷卻后轉(zhuǎn)入50 mL 容量瓶，用超純水定容。 處理好的樣品用ICP-OES 測定樣品中的銅含量。

1.5.3 TEM -EDS 分析腺胃和肝臟內(nèi)元素組成制作腺胃組織和肝臟組織的透射電鏡超薄切片，采用鎳網(wǎng)承載，醋酸雙氧鈾單染。 通過TEM 觀察靶器官和肝臟對納米氧化銅的攝取情況，對疑似納米氧化銅顆粒通過EDS 做能譜分析。

1.6 質(zhì)量控制 銅的加標(biāo)回收率為96. 55 ±3.24%，變異系數(shù)為1.93%。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 各數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析和LSD 多重比較。 各組數(shù)據(jù)均用X±SD 表示。 血銅濃度數(shù)據(jù)繪制藥時濃度曲線并采用DAS 3.0 軟件按照非靜脈給藥途徑進行非房室模型參數(shù)的計算。

2 結(jié)果

2.1 硫酸銅、微米氧化銅和納米氧化銅對蛋雞全血銅含量的影響 經(jīng)腺胃注入硫酸銅、微米氧化銅或納米氧化銅溶液后，在試驗期的2 ～36 h，受試雞全血銅含量均顯著高于對照組(P ＜0.05)，第2、4、6小時，納米氧化銅受試雞全血銅含量顯著高于硫酸銅組和微米氧化銅組(P ＜0.05)，見表2。

表2 硫酸銅、微米氧化銅和納米氧化銅對蛋雞全血銅含量的影響 (μg/L)

2.2 硫酸銅、微米氧化銅和納米氧化銅經(jīng)腺胃給藥的藥-時曲線 硫酸銅組、微米氧化銅組和納米氧化銅組經(jīng)腺胃給藥后的藥-時曲線趨勢類似，均先升高后降低，見圖1。

圖1 硫酸銅、微米氧化銅和納米氧化銅經(jīng)腺胃給藥后的藥-時曲線

2.3 硫酸銅、微米氧化銅和納米氧化銅經(jīng)腺胃給藥的主要藥物代謝動力學(xué)參數(shù)的比較 蛋雞經(jīng)腺胃注入不同銅源36 h，分析各組藥代動力學(xué)參數(shù)發(fā)現(xiàn)各組藥時曲線下面積(AUC0-∞)差異不顯著(P ＞0.05)；納米氧化銅組的達(dá)峰時間(Tmax)顯著低于硫酸銅組和微米氧化銅組(P ＜0.05)；納米氧化銅組的達(dá)峰濃度(Cmax)顯著高于微米氧化銅組(P ＜0.05)，表明納米氧化銅經(jīng)腺胃吸收后在蛋雞體內(nèi)吸收速率較快，見表3。

2.4 硫酸銅、微米氧化銅和納米氧化銅經(jīng)腺胃給藥36 h 后嗉囊和肝臟的銅含量的比較 蛋雞經(jīng)腺胃給藥不同銅源36 h 后，分析靶器官銅含量發(fā)現(xiàn)納米氧化銅組的腺胃和肝臟銅含量顯著高于對照組(P ＜0.05)，硫酸銅組的肝臟銅含量顯著高于納米氧化銅組(P ＜0.05)，表明納米氧化銅經(jīng)腺胃吸收后，大量銅被腺胃吸收，而轉(zhuǎn)運至肝臟的銅相對硫酸銅組較少，見表4。

表3 硫酸銅、微米氧化銅和納米氧化銅經(jīng)腺胃給藥的主要藥代動力學(xué)參數(shù)

表4 硫酸銅、微米氧化銅和納米氧化銅經(jīng)腺胃給藥后的器官銅含量 (mg/kg)

2.5 納米氧化銅經(jīng)腺胃給藥36 h 后腺胃和肝臟中的吸收分布狀態(tài) 蛋雞經(jīng)腺胃注入納米氧化銅混懸液36 h 后，經(jīng)TEM 觀察，在腺胃組織中發(fā)現(xiàn)球形顆粒聚團，EDS 分析發(fā)現(xiàn)，A 區(qū)域(內(nèi)含疑似顆粒)內(nèi)的銅元素峰值顯著高于B 區(qū)域(對照)，可確定疑似納米氧化銅顆粒，見圖2、圖3。 在肝臟中未發(fā)現(xiàn)疑似納米氧化銅顆粒，見圖4。 表明納米氧化銅顆粒能以內(nèi)吞的方式進入腺胃，但不能轉(zhuǎn)運至肝臟。

圖2 納米氧化銅在腺胃組織內(nèi)分布情況(TEM 照片) (3 000 ×)

圖3 利用EDS 對腺胃組織內(nèi)納米氧化銅(銅元素)定性鑒定

3 討論

圖4 納米氧化銅組肝臟的TEM 照片 (2 000 ×)

硫酸銅是目前應(yīng)用最廣泛的無機銅銅源添加劑，大量使用會增加銅元素的排泄量，造成環(huán)境污染[5]。 氧化銅的含銅量為78%，雖然含銅高，但研究表明，其對豬、雞和牛的生物可利用性均比硫酸銅和碳酸銅低[6]。 田相迪[7-8]等報道，在飼料中添加相同水平的銅，和微米氧化銅相比，肉雞飼料中添加納米氧化銅能顯著提高血清銅含量和肝臟銅含量，進一步研究發(fā)現(xiàn)，納米氧化銅的表觀消化率顯著高于硫酸銅和氧化銅。 杜利靜[9]通過給小鼠灌服納米氧化鋅證實了尺寸影響氧化鋅的攝入。由此可以看出納米顆粒在消化道吸收可能存在尺寸依賴性。 本實驗室前期研究證明，在飼料中添加納米氧化銅，骨骼銅含量和鋅沉積量顯著高于添加硫酸銅和氧化銅時，肝臟中的銅沉積以及肝臟中血漿銅藍(lán)蛋白(CP) mRNA 的表達(dá)量和血漿CP、Cu -ZnSOD、MAO 活性也顯著提高，而小腸、腺胃銅的含量反而降低，表明納米氧化銅比硫酸銅和氧化銅有更加便捷的吸收途徑[10-11]。 此外，在飼料中以硫酸鋅形式添加高水平鋅，發(fā)現(xiàn)沒有拮抗納米氧化銅的吸收利用[3，12]，也再次證明納米氧化銅吸收利用機制與硫酸銅有較大的差異。

本試驗發(fā)現(xiàn)，蛋雞腺胃吸收同水平的硫酸銅、微米氧化銅和納米氧化銅的血銅濃度隨時間變化，均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；納米氧化銅經(jīng)腺胃吸收后Tmax顯著低于硫酸銅和微米氧化銅，Cmax顯著高于微米氧化銅，說明納米氧化銅經(jīng)腺胃吸收速度快、吸收量大。 本試驗還發(fā)現(xiàn)，和微米氧化銅組和對照組相比，經(jīng)腺胃給藥納米氧化銅能顯著提高全血和腺胃銅含量，且納米氧化銅組肝臟銅含量顯著高于對照組。 經(jīng)TEM-EDS 技術(shù)在腺胃組織中觀測到納米氧化銅顆粒，而在肝臟中未發(fā)現(xiàn)類似的顆?；蛘呔蹐F，結(jié)合本課題組前期的研究[13-14]可以確定，納米氧化銅顆粒能以內(nèi)吞途徑進入腺胃，然后以銅離子的形式與銅蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)運到全身器官組織的。