孫 彬， 劉寶濤， 鄒 明， 劉煥奇

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院， 山東 青島 266109)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S. aureus )是導(dǎo)致奶牛乳房炎的主要病原菌之一，占到奶牛乳房炎中病原體的50%以上，是奶牛臨床上最難治療，并且造成經(jīng)濟損失最大的致病菌。 另外，金黃色葡萄球菌還是一種人獸共患菌，能夠通過乳制品等食物傳遞給人類，可引起人的尿路感染、骨髓炎、關(guān)節(jié)炎、腸炎等，同時也是造成食物中毒的常見致病菌之一[1-2]，嚴(yán)重影響公共衛(wèi)生食品安全。

目前，用抗生素仍是治療S. aureus 感染的主要措施，但隨著抗生素的過量及高頻率的使用、甚至濫用，使其耐藥譜不斷增大，出現(xiàn)對β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類等多類抗生素耐藥現(xiàn)象，包括重要的人醫(yī)用藥萬古霉素都出現(xiàn)對金黃色葡萄球菌的耐藥菌株，并且對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)有逐年增高的趨勢[3-4]，使得細(xì)菌耐藥性問題更加突出和復(fù)雜。 食源性細(xì)菌能夠?qū)⒛退幮詡鬟f給人類，對于臨床治療奶牛乳房炎和人類健康帶來巨大挑戰(zhàn)和隱患。 青島地區(qū)奶牛養(yǎng)殖量大，用藥情況復(fù)雜，并且與其相關(guān)的報道較少，本研究通過對青島地區(qū)奶牛場進行S. aureus 的分離鑒定及藥敏試驗，為指導(dǎo)治療奶牛乳房炎的合理用藥提供參考依據(jù)，為食品安全保障提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品 對青島地區(qū)14 個奶牛場進行樣品的采集，分別采取奶樣613 份、鼻拭子476 份、奶牛場飲水32 份、污水51 份及土壤樣品60 份，共計1 232 份樣品。 所采樣品放入冰盒中，3 h 內(nèi)運回實驗室進行處理。 牛乳樣品：對乳頭進行消毒后，棄三把奶后取奶樣置于滅菌的10 mL 離心管中編號，保存?zhèn)溆?；鼻拭子樣品：用滅菌的棉簽蘸取奶牛的鼻液，放入裝有7.5% NaCl LB 的5 mL 離心管中編號，保存?zhèn)溆茫伙嬎?、污水及土壤樣品：用滅菌?0 mL 離心管對不同牛舍的飲水及污水進行采集，對牛場的不同區(qū)域進行土壤樣品的采集。

1.2 試劑與藥品 Baird-Parker 瓊脂基礎(chǔ)、MH 肉湯、MH 瓊脂、LB 肉湯和亞碲酸鹽卵黃增菌液，均購自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)菌生化微量鑒定管，購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；Taq 酶、Marker，購自TaKaRa 試劑公司；藥敏試驗藥物(青霉素、苯唑西林、頭孢西丁、萬古霉素、慶大霉素、紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、利福平、甲氧芐啶、氨芐西林、頭孢噻呋、泰妙菌素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、利奈唑胺、氯霉素)，購自上海麥克林試劑公司。

1.3 方法

1.3.1 增菌培養(yǎng) 將采集的鼻拭子置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 ～24 h；將奶樣以4 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入7.5% NaCl LB 吹勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 ～24 h；分別吸取100 μL 的飲水和污水加入到7.5% NaCl LB 中吹勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 ～24 h；向土壤中加入LB 肉湯，放置5 ～10 min，吸取上清加入到7.5% NaCl LB 中吹勻，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 ～24 h。

1.3.2 分離培養(yǎng) 將各種樣品的增菌液劃線接種于Baird-Parker 瓊脂上，37 ℃培養(yǎng)20 ～24 h 后，觀察其菌落形態(tài)特征。

1.3.3 純化培養(yǎng) 在Baird-Parker 平板上挑取疑似菌落進行純化，重復(fù)兩次然后進行革蘭染色。 純化后，進行增菌及保菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 血漿凝固酶試驗 接種肉湯培養(yǎng)物于兔血漿中，充分混合，37 ℃培養(yǎng)，每30 min 觀察1 次，將安瓿瓶倒置或傾斜，內(nèi)容物不流動為陽性，若2 h 后無上述現(xiàn)象，則放置過夜后再觀察。

1.3.5 PCR 鑒定 參考文獻[5]，根據(jù)S. aureus 的特異性基因—耐熱核酸酶基因nuc 合成引物，引物序列如下nuc F：5′-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3′；nuc R：5′-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3′。采用CTAB- NaCl 法提取細(xì)菌組DNA，進行PCR 檢測。 擴增片段長度270 bp。 反應(yīng)體系25 μL：水18.375 μL，PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，Taq 酶0.125 μL。擴增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s 30 個循環(huán)，再延伸5 min。

1.3.6 藥敏試驗 金黃色葡萄球菌ATCC 29213作為藥敏試驗的質(zhì)控菌株。 對PCR 鑒定得到的S. aureus 根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標(biāo)準(zhǔn)采用瓊脂稀釋法對青霉素(PEN)、苯唑西林(OXA)、頭孢西丁(FOX)、萬古霉素(VAN)、慶大霉素(GEN)、紅霉素(ERY)、克林霉素(CLI)、左氧氟沙星(OFL)、利福平(RIF)、甲氧芐啶(TRI)、氨芐西林(AMP)、頭孢噻呋(CEF)、泰妙菌素(TIA)、恩諾沙星(ENR)、環(huán)丙沙星(CIP)、四環(huán)素(TET)、利奈唑胺(LZD)、氯霉素(CHL)18 種抗菌藥物進行藥敏試驗，獲得其MIC 值，判斷藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 分離純化結(jié)果 采集樣品經(jīng)分離純化后，在BP 瓊脂上呈現(xiàn)圓形、凸起、灰色或黑色、有光澤、周圍伴有沉淀環(huán)的菌株挑選為疑似菌株，共計78 株。

2.2 凝固酶試驗結(jié)果 對78 株疑似菌株進行凝固酶試驗，有59 株呈現(xiàn)凝固酶陽性。

2.3 PCR 鑒定結(jié)果 經(jīng)PCR 鑒定，59 株凝固酶陽性菌株均擴增出270 bp 大小的目的片段，鑒定結(jié)果如圖1，由于菌株較多，只挑選幾株菌的電泳圖，并隨機挑選部分菌株進行測序，結(jié)果進行BLAST，相似度高于99%確定為金黃色葡萄球菌。 從不同樣品的分離結(jié)果可以看出(見表1)，59 株金黃色葡萄球菌在奶樣中的分離率為5.5%(34/613)，在鼻拭子中的分離率為3.6%(17/476)，在飲水中的分離率為6.3%(2/32)，在污水中的分離率為5.9%(3/51)，在土壤中的分離率為5%(3/60)。

從不同養(yǎng)殖場的分離結(jié)果看，59 株金黃色葡萄球菌來自14 個養(yǎng)殖場中的7 個場，陽性場率為50%，其中有6 個場的分離率介于3.5%-12.9%之間，差別不等，另外1 個養(yǎng)殖場的分離率為33.8%，差別明顯，其分離率見表2。

圖1 nuc 基因(270 bp)的瓊脂糖凝膠電泳圖

表1 不同樣品的分離率

表2 14 個奶牛場的S. aureus 分離率/%(陽性數(shù)/樣品數(shù))

2.4 藥敏試驗結(jié)果 59 株金黃色葡萄球菌除對氯霉素表現(xiàn)為全部敏感外，對其他17 種藥物(共12 類抗菌藥物)均出現(xiàn)了不同程度的耐藥，其中以2 耐為主，占分離菌株的40.7%，3 耐及3 耐以上菌株占分離菌株的42.5%，有1 株耐藥菌表現(xiàn)出對10 類抗生素耐藥，多重耐藥結(jié)果見表3。

59 株金黃色葡萄球菌對氨芐西林耐藥率最高，為86.4%，對青霉素、苯唑西林和甲氧芐啶耐藥率較高，分別為71.2%、74.6%和74.6%，對紅霉素的耐藥率為44.1%，對第2 代頭孢菌素類頭孢西丁的耐藥率為30.5%，對第3 代動物專用頭孢菌素頭孢噻呋和慶大霉素的耐藥率較低，都為3.4%。 本試驗檢測到重要的人醫(yī)臨床用藥萬古霉素和利奈唑胺耐藥菌株，耐藥率分別為8.5%(5/59)和10.2%(6/59)，從分離出萬古霉素和利奈唑胺耐藥菌株的陽性場情況看，萬古霉素耐藥細(xì)菌陽性場占全部采樣場的14.3%(2/14)，且分離得到的5 株萬古霉素耐藥菌株均來自牛乳樣品中，利奈唑胺耐藥細(xì)菌陽性場占全部采樣場的21.4%(3/14)，6 株利奈唑胺耐藥菌株分別來自污水3 株、牛乳樣品2 株和土樣1 株，具體耐藥情況見表4。

3 討論

3.1 金黃色葡萄球菌的分離率分析 本試驗通過微生物學(xué)方法及PCR 鑒定，從1 232 份樣品中分離出59 株金黃色葡萄球菌，分離率為4.8%，其中共采集奶樣613 份，分離出34 株金黃色葡萄球菌，分離率為5.5%，明顯低于劉文進報道[6]的金黃色葡萄球菌分離率78.98%，并且從表2 中可以看出，場3 與其他各場的分離率相差較大，并且飲水和土壤中都分離得到金黃色葡萄菌，可見其污染嚴(yán)重，這可能與奶牛場的飼養(yǎng)管理、養(yǎng)殖環(huán)境條件有關(guān)，因此應(yīng)該注意養(yǎng)殖場的環(huán)境，完善其管理制度，提高工作人員的防污染意識以及擠奶人員的熟練度。

在污水、飲水及土壤中分離出來的金黃色葡萄球菌可能是引起奶牛感染的一條重要途徑，需要進一步的研究。 本試驗使用PCR 方法，根據(jù)金黃色葡萄球菌特有的耐熱核酸酶基因(nuc)，在該菌DNA片段中為高保守的序列[7]，查找引物進行鑒定，該方法具有較好的特異性、快速敏捷、操作方便，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于致病菌的檢測中[8-9]。

表3 59 株金黃色葡萄球菌的多重耐藥情況

表4 59 株金黃色葡萄球菌的藥敏試驗結(jié)果___________________________________

3.2 金黃色葡萄球菌的藥物敏感性分析 隨著抗生素的長期使用，使得耐藥菌大量出現(xiàn)，造成許多常用抗生素降低甚至失去其治療效果。 本研究表明，分離得到的59 株金黃色葡萄球菌除了10 株菌只對一類抗生素(1 株對利福霉素類，6 株對β-內(nèi)酰胺類，3 株對磺胺類)耐藥，其余各菌都具有較廣的耐藥譜，三耐及三耐以上菌株占所有菌株的42.5%，其中有1 株對10 類抗生素耐藥，說明本試驗獲得的菌株多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，應(yīng)該注意合理科學(xué)用藥，避免抗生素的濫用和超劑量使用，以免到時出現(xiàn)無藥可醫(yī)的現(xiàn)象。

59 株金黃色葡萄球菌對青霉素、氨芐西林、甲氧芐啶及苯唑西林耐藥率較高，分別為71.2%、86.4%、74.6%和74.6%，低于王冰[10]報道的青霉素G(99.5%)，氨芐西林(100%) 和甲氧芐啶(100%)，高于劉敬蘭[11]報道的苯唑西林耐藥率(49%)。 對慶大霉素和頭孢噻呋的敏感性也很高，均為96.6%，與錫林高娃等[12]報道的慶大霉素敏感性(100%)和J. G. Rola[13]報道的頭孢噻呋敏感性(100%)相接近，對第二代頭孢菌素類頭孢西丁的耐藥率為30.5%，要高于劉敬蘭[11]報道的頭孢西丁耐藥率(17%)，對氯霉素的敏感性最高，為100%。

如上所述，59 株金黃色葡萄球菌對常用藥物表現(xiàn)出不同程度耐藥，并且對分離出金黃色葡萄球菌的7 個奶牛場的用藥史進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)7 個場均長期使用β-內(nèi)酰胺類藥物，并且有3 個場還經(jīng)常使用紅霉素，對于其他抗菌藥物使用較少，這種頻繁的使用單一抗菌藥物對致病菌已沒有明顯的效果，所以為減緩耐藥菌株的出現(xiàn)，可以考慮對金黃色葡萄球菌病的治療采用聯(lián)合用藥和輪轉(zhuǎn)用藥。

值得注意的是，萬古霉素作為人類對付頑固性耐藥細(xì)菌的“最后一道防線”及重要的人醫(yī)用藥，可以通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中的磷脂和多肽來干擾細(xì)菌的生長和繁殖，并且不易和其他抑制細(xì)菌蛋白合成的抗菌藥物產(chǎn)生交叉耐藥，具有無交叉耐藥性特點，很少出現(xiàn)耐藥菌株，因此對于治療多重耐藥革蘭陽性球菌引起的感染很有效果，并且是治療MRSA 感染的一線用藥。 在本研究中共分離得到5株耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(Vancomycin resistant S， aureus， VRSA)，且均來自奶樣品中，雖然其耐藥率為8.5%(5/59)，相比其他抗生素耐藥率而言較低，但也存在人與動物之間進行傳播的可能性以及將耐藥性通過奶制品傳遞給人類的風(fēng)險性，發(fā)展成為重要的公共衛(wèi)生隱患，所以應(yīng)該了解VRSA 的分布及耐藥情況，找出導(dǎo)致VRSA 的感染途徑，控制其感染并指導(dǎo)合理用藥，不斷提高VRSA 的防治水平。

利奈唑胺屬于 惡唑烷酮類化學(xué)合成的抗生素，我國于2007 年9 月僅批準(zhǔn)用于人醫(yī)臨床治療MRSA 等，對于多重耐藥革蘭陽性球菌的感染，并未批準(zhǔn)用于獸醫(yī)臨床，但本研究中確檢測到利奈唑胺耐藥菌株，其耐藥率為10.2%(6/59)，一方面可能是因為在使用利奈唑胺時未按照要求，將其直接用于奶牛疾病的治療，導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生；另一方面，介導(dǎo)利奈唑胺耐藥的cfr 基因大多數(shù)位于質(zhì)粒上，可在不同種細(xì)菌或不同屬細(xì)菌間進行水平轉(zhuǎn)移，在臨床分離細(xì)菌之間、甚至動物來源細(xì)菌以及環(huán)境細(xì)菌之間相互傳播，導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。