李紅歡， 陳 朔， 康立超， 馬 勛， 錢凌霄， 張奇文， 杜冬冬

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 新疆 石河子 832003 ；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院分析測(cè)試中心， 新疆 石河子 832003)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，以下簡(jiǎn)稱：?jiǎn)卧隼钏固鼐?，是細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭陽(yáng)性短桿菌，一種重要的食源性人獸共患病原菌，該菌在4 ℃環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖，通過(guò)污染奶及奶制品、蔬菜、水產(chǎn)品、肉制品等食物導(dǎo)致人群感染，是冷藏食品中威脅人類健康的主要病原菌之一[1]。該菌致病性強(qiáng)、致死率高達(dá)30%[2]，能引起人和動(dòng)物李斯特菌病，如人類的腦膜炎、敗血癥、肺炎、熱性胃腸炎、流產(chǎn)等疾病[3]，新生兒、孕婦、老年人和免疫功能低下者更易感染發(fā)病[4]， 由于感染此菌的高致死率，我國(guó)對(duì)食源性單增李斯特菌的檢測(cè)十分重視，作為國(guó)家食品污染物和有害因素風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)必檢微生物指標(biāo)之一[5]。

近年來(lái)因食品污染本菌而引起的食物中毒病例頻繁發(fā)生，使李斯特菌病作為一種重要的食源性傳染病在世界范圍內(nèi)對(duì)食品安全及人類健康造成極大的危害[6]。 歐盟報(bào)道，加拿大2009 年共發(fā)生了1 645 例由單增李斯特菌引起的食物中毒病例，比2008 年增加了19.1%[7]。 李斯特菌生命力強(qiáng)，能在低溫環(huán)境甚至冰箱內(nèi)存活，主要以食物為傳染媒介，是最致命的食源性病原體之一，會(huì)造成二至三成的感染者死亡。 2015 年，美國(guó)出現(xiàn)藍(lán)鐘( Blue Bell) 冰淇淋事件， 3 人感染死亡。 我國(guó)2000 -2009 年文獻(xiàn)檢索出單增李斯特菌病例92 例[8]。 國(guó)內(nèi)外報(bào)道從多種食品中分離到李斯特菌或食品污染李斯特菌而引起的食物中毒暴發(fā)事例[9]，為此單增李斯特菌成為新的重要的食源性疾病病原菌，已引起了食品衛(wèi)生管理部門的廣泛關(guān)注，許多國(guó)家均加強(qiáng)了對(duì)該菌的檢測(cè)及研究工作。

李斯特菌病相對(duì)罕見(jiàn)，然而一旦發(fā)生，病死率很高，因而準(zhǔn)確及時(shí)地早期診斷及合理的抗生素治療顯得尤為重要[10]。 隨著抗生素在臨床和畜牧業(yè)中的廣泛使用與濫用，單增李斯特菌面臨嚴(yán)重的抗生素選擇壓力，已有報(bào)道[11]指出，我國(guó)出現(xiàn)對(duì)二線藥物耐藥的菌株，給臨床用藥的選擇帶來(lái)了很大的挑戰(zhàn)。 為了解新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)食源性單增李斯特菌分離株的耐藥性，本研究對(duì)食源性單增李斯特菌進(jìn)行耐藥性的測(cè)定，為有效控制細(xì)菌耐藥、科學(xué)評(píng)價(jià)單增李斯特菌分離株致病意義提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源 2014 年新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)8 個(gè)師，常規(guī)送檢的外賣盒飯158 份，冷凍魚糜制品121份、調(diào)理肉制品90 份，學(xué)生餐270 份，生食肉類50份，涼拌菜21 份，冷凍飲品10 份，雞2 份，奶酪3份，糕點(diǎn)2 份等10 類食品共計(jì)727 份，用于檢測(cè)單增李斯特菌。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株 單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株標(biāo)號(hào)為27708；藥敏質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923。

1.3 培養(yǎng)基和試劑 李氏增菌肉湯(LB1，LB2)，TSA-YE；PALCAM 瓊脂，單增李斯特菌顯色培養(yǎng)基CHROM agar，腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)， 購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；青霉素、四環(huán)素、慶大霉素、環(huán)丙沙星等17 種抗生素藥敏紙片，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.4 方法

1.4.1 單增李斯特菌的分離培養(yǎng)與鑒定 參照《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)》GB4789/T.30 -2010[12]并結(jié)合《全國(guó)食品污染物監(jiān)測(cè)計(jì)劃- 食源性致病菌》部分方法進(jìn)行。

(1)增菌：無(wú)菌操作提取樣品25 g(mL)加入到含有225 mL LB1 增菌液的均質(zhì)袋中，在均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1 min ～2 min；或放入盛有225 mL LB1 增菌液的均質(zhì)杯中，8 000 r/min ～10 000 r/min 均質(zhì)1 min ～2 min。 于30 ℃培養(yǎng)24 h，移取0.1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mL LB2 增菌液內(nèi)，在30 ℃培養(yǎng)18 h ～24 h。

(2)分離及培養(yǎng)：取LB2 二次增菌液劃線接種于PALCAM 或CHROM agar 瓊脂平板上，在36 ℃培養(yǎng)24 h ～48 h。 再將上述顯色平板上的可疑菌落接種TSA-YE 平板和兔血平板上，30 ℃生長(zhǎng)24 h 后，觀察菌落和溶血情況。

(3)鑒定：挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭染色，顯微鏡下觀察其形態(tài)和染色特性。 挑取可疑菌落進(jìn)行GP鑒定卡鑒定。 鑒定試驗(yàn)用單核細(xì)胞增生性李斯特標(biāo)準(zhǔn)菌株做陽(yáng)性對(duì)照。

1.4.2 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)按WHO 推薦的K-B瓊脂紙片擴(kuò)散法[13]進(jìn)行，培養(yǎng)基為BHI 瓊脂固體培養(yǎng)基。 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)菌取500 μL 用涂布器均勻涂抹于BHI 固體培養(yǎng)板上；待培養(yǎng)基表面菌液吸收后，無(wú)菌鑷子夾取藥敏片貼于培養(yǎng)基表面，藥敏片間距不少于30 mm；37 ℃條件下培養(yǎng)24 h 后，游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑并做記錄。 藥敏結(jié)果判定采用NCCLS(CLSI)《微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》M100 -S20[14]。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定 分離獲得24 株可疑細(xì)菌，菌落在PALCAM 瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。 在CHROM agar 上的小的圓形藍(lán)色菌落，周圍有白色暈圈。 在TSA-YE 平板上30 ℃生長(zhǎng)24 h 后，可形成半透明的圓形露滴狀菌落。 兔血平板上呈現(xiàn)β溶血。 可疑菌落為革蘭陽(yáng)性的短桿菌，單個(gè)、兩兩平行或排列成“V”字型。 經(jīng)VITEK2-compact 全自動(dòng)微生物鑒定儀GP 卡鑒定為單增李斯特菌，鑒定符合率為99.9%。

2.2 食品中單增李斯特菌檢出情況 727 份樣品中檢出單增李斯特菌24 株，總檢出率為3.3%。 其中，調(diào)理肉制品檢出率最高，為17.77%；其次是冷凍肉糜制品，檢出率為4.95%；外賣盒飯中檢出率為1.26%；學(xué)生餐、生食肉類、涼拌菜、冷凍飲品、雞、奶酪、糕點(diǎn)等樣品中未檢出該菌(表1)。

2.3 藥物敏感 24 株單增李斯特菌分離株的17種抗生素藥敏試驗(yàn)顯示：對(duì)青霉素和環(huán)丙沙星耐藥率100%，對(duì)磷霉素、氨芐西林、丁胺卡那霉素、復(fù)方新斯諾明、四環(huán)素耐藥率分別為54.17%、37.5%、20.83%、20.83%、16.66%。 大部分菌株對(duì)頭孢唑林、頭孢噻吩、亞胺培南、左氧氟沙星、諾氟沙星、強(qiáng)力霉素、萬(wàn)古霉素、氯霉素、紅霉素、慶大霉素敏感。

表1 樣品數(shù)量及單增李斯特菌檢出率

除LM461，LM4786，LM3189，LM3195，LM5470，LM5474 等6 株菌只對(duì)青霉素和環(huán)丙沙星耐藥外，其余菌株均表現(xiàn)多重耐藥，多重耐藥菌株占總分離株的75.0 %。 其 中 LM2935、 LM2956、 LM3197、LM5563、LM5573、 LM3103-1、LM6072 大和LM6072小等8 株菌出現(xiàn)3 重耐藥，占總分離株的33.3%；LM502、LM2941、LM3251、LM4786 和LM5570 等5株菌出現(xiàn)4 重耐藥，占總分離株的20.8%；LM472、LM2947、LM4788、LM5567 和LM502-2 等5 株菌出現(xiàn)5 重以上耐藥，占總分離株的20.8%。

3 討論

單增李斯特菌作為四大食源性致病菌之一，由于其感染病死率高、危害大，日益引起人們的重視。在國(guó)外，單增李斯特菌在RTE 食品中的污染率報(bào)道較多。 Inoue[15]等的研究表明日本零售食品單增李斯特菌污染率為5.4% ～25%，牛肉、豬肉、雞肉單增李斯特菌的污染率分別為12.2%，20.6% 和37%。 Prazak[16]等研究發(fā)現(xiàn)卷心菜的單增李斯特菌污染率約為3%。 楊紅菊[17]等在130 份畜禽產(chǎn)品樣品中共檢出致病菌46 株，其中單增李斯特菌的檢出率為16.9%，且細(xì)分品種，豬肉中單增李斯特菌檢出率最高。 龔云偉等[18]對(duì)市售26 份熟肉制品的分析結(jié)果顯示，有26.9%的單增李斯特菌陽(yáng)性。 古麗巴哈爾·托乎提[19]等在冷凍飲品中檢出單增李斯特菌。 劉海霞[20]等在2010 -2016 年熟肉制品和餐飲食品中共檢出單增李斯特菌85 株， 占所采樣品的1.65%，采集的熟肉制品和餐飲食品中， 污染較為嚴(yán)重的分別為醬肉類和中式?jīng)霭瑁?檢出率分別為2.66%和2.67%。 沙拉麥提·吐?tīng)栠d太[21]對(duì)新疆烏魯木齊食品單增李斯特菌檢出率的18.5%。此次常規(guī)送檢的727 件食品中共檢出單增李斯特菌24 株，檢出率為3.3%，檢出率比較低。 在食品分布中以調(diào)理肉制品污染較為嚴(yán)重，陽(yáng)性率達(dá)17.77%，說(shuō)明單增李斯特菌在國(guó)內(nèi)、外的不同地區(qū)、不同類型食品分布存在差異。 本次單增李斯特菌的污染狀況雖然不是很嚴(yán)重，但也存在單增李斯特菌引起食源性疾病的潛在危險(xiǎn)。

表2 24 株單增李斯特菌分離株對(duì)抗生素敏感性_________________________________

通常臨床用于治療李斯特菌病的一線藥物主要是氨芐西林或青霉素，單獨(dú)使用或與慶大霉素聯(lián)合使用，而復(fù)方新諾明、萬(wàn)古霉素與慶大霉素聯(lián)合紅霉素及氟喳諾酮作為二線藥物。 本研究中對(duì)分離到的24 株單增李斯特菌進(jìn)行17 種抗生素的藥物敏感性試驗(yàn)， 24 株單增李斯特菌對(duì)青霉素和環(huán)丙沙星耐藥；部分菌株對(duì)磷霉素、氨芐西林、丁胺卡那霉素、復(fù)方新斯諾明、四環(huán)素、諾氟沙星和強(qiáng)力霉素耐藥；耐藥率分別為54.17%、37.5%、20.83%、20.83%、16.66%、8.33% 和8.33%。 且出現(xiàn)多重耐藥菌株，其中有5 株菌出現(xiàn)5 重以上耐藥，占總分離株的20.8%。 這與楊洋[22]對(duì)2005 年全國(guó)467 株食源性單增李斯特菌只對(duì)四環(huán)素和環(huán)丙沙星耐藥，且沒(méi)有多重耐藥情況結(jié)果并不一致，但與趙悅[23]等對(duì)2007 -2009 年來(lái)自22 個(gè)地區(qū)9 類1 069 株食品源單增李斯特菌的耐藥性分析，主要耐受四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、紅霉素、氯霉素和環(huán)丙沙星，耐藥率6.92%，并出現(xiàn)了多重耐藥株，以及閆韶飛[24]報(bào)道的2012 年635 株食品源單增李斯特菌主要耐受四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、紅霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星，平均耐藥率10.39%，出現(xiàn)多重耐藥結(jié)果有相似之處，表明不同地區(qū)單增李斯特菌的耐藥情況不同，并且隨著時(shí)間的推移，耐藥率逐漸提高，且出現(xiàn)多重耐藥，提示臨床用藥前景堪憂。 雖然全球范圍的單增李斯特菌臨床用藥耐藥率還較低，但耐藥譜很廣，并出現(xiàn)了對(duì)青霉素和慶大霉素等一線用藥的耐受。 應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對(duì)單增李斯特菌耐藥性的監(jiān)測(cè)，規(guī)范抗生素在臨床和畜牧業(yè)的使用，以減緩耐藥基因的轉(zhuǎn)移和降低食源性耐藥菌株的出現(xiàn)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)727 份食品運(yùn)用食品應(yīng)用國(guó)標(biāo)法進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，檢出單增李斯特菌24 株，并采用紙片擴(kuò)散法對(duì)其進(jìn)行了藥物敏感試驗(yàn)，為有效控制細(xì)菌耐藥、科學(xué)評(píng)價(jià)單增李斯特菌分離株致病意義提供科學(xué)依據(jù)。