莫優(yōu)煉 楊六成 胡小華 陳茂芳 段立鋒 蘇嘉鴻 張平鋒鐘陳 張家德 馮大軍

先天性巨結(jié)腸（Hirschsprung’s disease，HD）是小兒常見(jiàn)的先天性腸道疾病之一，發(fā)病是由于結(jié)腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺乏引起腸管持續(xù)痙攣，進(jìn)而糞便淤滯結(jié)腸近端，長(zhǎng)期淤滯使該段結(jié)腸肥厚擴(kuò)張[1-2]。HD臨床上常表現(xiàn)為胎便排出障礙、患兒便秘腹脹及營(yíng)養(yǎng)不良等，HD在很大程度上影響幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育，不利于其正常的學(xué)習(xí)與生活。本研究通過(guò)觀察HD不同節(jié)段腸壁神經(jīng)、平滑肌的分布特點(diǎn)，探究HD手術(shù)結(jié)腸切除范圍及術(shù)后胃腸功能紊亂的原因，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月-2016年12月本院收治的手術(shù)切除的46例HD標(biāo)本，設(shè)其為觀察組。選取本院同期收治的死于與胃腸道疾病無(wú)關(guān)的同年齡段的25例患兒的結(jié)腸標(biāo)本，將其設(shè)為對(duì)照組。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：觀察組參照文獻(xiàn)[3]中HD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，患兒有HD相關(guān)臨床癥狀、經(jīng)腹部平片和鋇劑灌腸等影像學(xué)檢查及肛門(mén)直腸側(cè)壓臨床診斷為HD；術(shù)后病理診斷確診為HD。兩組患兒需有完整的病例資料；家屬知情研究，并簽署同意書(shū)。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有其他腸道疾病、類(lèi)源性巨結(jié)腸者；HD標(biāo)本無(wú)法滿足研究要求者。研究具體事項(xiàng)已上報(bào)相關(guān)部門(mén)，醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)此研究。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化法 存檔蠟塊，以腸管縱軸為固定方向，從遠(yuǎn)端到近端手術(shù)切除點(diǎn)每2厘米進(jìn)行1次取材。（1）SP法：常規(guī)脫蠟，采用3%的H2O2在37 ℃條件下孵育10 min左右；之后進(jìn)行抗原修復(fù)，修復(fù)時(shí)微波溫度控制在92～98 ℃，時(shí)間為10 min，選擇0.01 mol/L的枸櫞酸緩沖液（pH=6.0）作為Syn、NCAM抗原修復(fù)液；運(yùn)用正常羊血清工作液封閉，滴入稀釋度均為1∶100的兔抗人Syn/NCAM單克隆抗體，4 ℃環(huán)境下孵育過(guò)夜，PBS緩沖液代替一抗起陰性對(duì)照作用。二抗選用抗兔SP試劑盒。DAB/H2O2染色，充分沖洗后再蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、干燥、封片。（2）蘇木素-伊紅染色：所有標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行HE染色。

1.3 觀察指標(biāo) （1）記錄兩組肌間神經(jīng)叢、叢內(nèi)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量。（2）肌層厚度、厚度比：在HE染色后通過(guò)低倍鏡觀察，隨機(jī)選取10個(gè)視野，借助測(cè)微尺對(duì)環(huán)、縱肌的厚度進(jìn)行測(cè)量，并計(jì)算厚度比。每小格為10 μm。（3）肌層病變：對(duì)肌層的空泡變性程度分為四個(gè)等級(jí)，無(wú)（-）、少量（+）、中等量（++）、大量（+++）。（4）免疫組化染色（Syn、NCAM染色）：用于判斷腸壁肌層中陽(yáng)性著色的神經(jīng)纖維分布情況。參考文獻(xiàn)[4]中相關(guān)內(nèi)容將分布密度分為四等級(jí)，陰性（-）：無(wú)著色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)不超過(guò)10%；弱陽(yáng)性（+）：黃色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)不超過(guò)25%；中度陽(yáng)性（++）：棕色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)不超過(guò)50%；強(qiáng)陽(yáng)性（+++）：棕褐色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)超過(guò)50%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料應(yīng)用（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)，等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒的一般資料比較 觀察組的患兒年齡1～10個(gè)月，平均（4.57±2.26）個(gè)月；46例都為短段型、普通型的HD。對(duì)照組的患兒年齡1～11個(gè)月，平均（4.89±2.02）個(gè)月。兩組的一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 HE染色 （1）HE染色后對(duì)照組的標(biāo)本。腸壁結(jié)構(gòu)完整、顯示清晰，環(huán)肌厚度/縱肌厚度為（1.98±0.13），比值正常，在肌間、黏膜下可見(jiàn)豐富神經(jīng)叢，叢中同樣有豐富神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。（2）觀察組標(biāo)本形態(tài)學(xué)變化。①狹窄段：該段神經(jīng)叢數(shù)量少于對(duì)照組（P＜0.05）；肌間神經(jīng)叢中未見(jiàn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且其內(nèi)的神經(jīng)纖維增粗、排列異常；在痙攣節(jié)段環(huán)、縱肌層均增厚（P＜0.05）；兩肌層厚度比值為（1.47±0.07），比例失調(diào)。②移行段：神經(jīng)叢內(nèi)可見(jiàn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，且細(xì)胞為幼稚的和少量成熟的；肌層增厚，環(huán)、縱肌層厚度比為（1.67±0.79），有肌層空泡樣變。③擴(kuò)張段：肌間神經(jīng)叢的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞仍然少于正常對(duì)照組，在距該段遠(yuǎn)端8 cm位置神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)基本達(dá)到正常水平，與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在擴(kuò)張段-0、2、4、6 cm處兩肌層厚度均增厚，遠(yuǎn)端8 cm處兩肌層厚度較之前有變薄，但與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；擴(kuò)張段各處的環(huán)縱比與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。肌層有空泡樣變。（3）兩組的空泡樣程度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

2.3 免疫組化 （1）Syn。對(duì)照組的腸段有豐富肌間神經(jīng)叢；在低倍鏡下可見(jiàn)黃褐色染色的小型團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)；高倍鏡下神經(jīng)節(jié)的胞質(zhì)呈黃褐色深染狀態(tài)，在其中有圓形胞核，偶爾可以在腺體處見(jiàn)棕黃色顆粒。在觀察組的狹窄段的肌間有神經(jīng)束，且該束支為Syn陽(yáng)性增粗狀態(tài)，未見(jiàn)神經(jīng)叢內(nèi)有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，與對(duì)照組比較，該段增粗的神經(jīng)干計(jì)數(shù)多、肌層內(nèi)神經(jīng)纖維分布密度高，尤其是環(huán)肌層；分析移行段低倍鏡下的情況，其神經(jīng)纖維分布密度高于狹窄段；分析肌層神經(jīng)纖維在擴(kuò)張段的分布情況，該段纖維分布密度比對(duì)照組高，到距該段遠(yuǎn)端8 cm處的肌肉與肌間的密度比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。（2）NCAM。腸段的肌內(nèi)神經(jīng)叢為NCAM陽(yáng)性表達(dá)的主要區(qū)域。胞質(zhì)為NCAM的定位處，在神經(jīng)叢中的幼稚的精神節(jié)細(xì)胞和神經(jīng)纖維中NCAM呈弱陽(yáng)性表達(dá)。狹窄段腸壁肌間表現(xiàn)為增粗的神經(jīng)干、肌內(nèi)神經(jīng)纖維的NCAM檢查分別呈強(qiáng)陽(yáng)性、陽(yáng)性。肌間NCAM表達(dá)在移行段為中度陽(yáng)性，可見(jiàn)幼稚神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞質(zhì)深染、胞體小、未見(jiàn)大核仁。在擴(kuò)張段NCAM在肌間、肌肉神經(jīng)組織中的表達(dá)弱，觀察到成熟神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞質(zhì)淡染、核大、可見(jiàn)明顯核仁；在距該段遠(yuǎn)端8 cm處與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表1 兩組肌間神經(jīng)叢、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、肌層厚度和厚度比比較（±s）

表1 兩組肌間神經(jīng)叢、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、肌層厚度和厚度比比較（±s）

注：*P＜0.01、**P＜0.05，除擴(kuò)張段-8以外，其他節(jié)段的肌間神經(jīng)叢、叢間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞與對(duì)照組比較；各節(jié)段的環(huán)、縱肌層厚度均大于對(duì)照組。

組別 神經(jīng)叢（個(gè)/低倍視野×100）神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（個(gè)/低倍視野×400）環(huán)肌層厚度（μm×102/低倍視野）縱肌層厚度（μm×102/低倍視野）環(huán)縱厚度比對(duì)照組（n=25） 7.66±0.48 5.16±0.41 3.82±0.35 1.93±0.17 1.98±0.13觀察組（n=46） 狹窄段 5.37±0.28* 0* 4.05±0.20* 2.94±0.16* 1.47±0.07移行段 4.76±0.29* 1.63±0.73* 7.03±0.20* 4.24±0.17* 1.67±0.79擴(kuò)張段 -0 5.88±0.25** 3.91±0.34* 10.21±0.14* 4.57±0.11* 2.35±0.69擴(kuò)張段 -2 6.05±0.26** 4.04±0.17** 12.36±0.19* 4.98±0.13* 2.57±0.08擴(kuò)張段 -4 6.62±0.23** 4.18±0.35** 11.21±0.13* 5.16±0.26* 2.33±0.06擴(kuò)張段 -6 7.04±0.24** 4.46±0.39** 11.11±0.13* 4.92±0.13* 2.26±0.06擴(kuò)張段 -8 7.55±0.23 4.87±0.21 9.81±0.12* 4.66±0.31* 2.18±0.04

表2 兩組肌層空泡樣變比較 例

3 討論

HD又稱(chēng)為腸管無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥，臨床通常表現(xiàn)為腸梗阻的癥狀[5]。文獻(xiàn)[6-9]數(shù)據(jù)表明，HD在新生兒中的發(fā)病率在1/5 000左右，且發(fā)病存在性別、種族差異，男性發(fā)病多于女性。目前，HD的治療方式主要為保守和手術(shù)治療，一旦診斷明確、病情加重、術(shù)前準(zhǔn)備充足則多選擇通過(guò)巨結(jié)腸根治術(shù)解除癥狀[10]。當(dāng)HD伴發(fā)小腸結(jié)腸炎時(shí)，如果治療不及時(shí)將會(huì)危及患兒生命，提高死亡率[11]。目前，HD的術(shù)前診斷方式都存在一定局限性，例如不能較好確定病變的性質(zhì)和范圍、不易與HD類(lèi)緣疾病鑒別等，這些不足很大程度上為HD的診斷增加難度[12]。因此，根治術(shù)術(shù)前即對(duì)直腸黏膜活檢標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)標(biāo)志物的免疫學(xué)檢測(cè)具有重要意義，同時(shí)選用特異性的抗體是關(guān)鍵。

Syn是一種存在于突觸小泡膜表面的特有蛋白質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)胃腸功能，且功能的發(fā)揮與興奮傳導(dǎo)相關(guān)[13]。在腸壁神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、神經(jīng)纖維中Syn都呈陽(yáng)性表達(dá)，而Syn陽(yáng)性突觸囊泡則隨著腸段神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的變化而變化，其陽(yáng)性突觸囊泡在環(huán)、縱肌層中的布局主要顯示結(jié)腸蠕動(dòng)功能的分布情況，此外，它還能說(shuō)明病變部位的肌間、黏膜下的神經(jīng)叢都發(fā)生了病理改變，通常體現(xiàn)為神經(jīng)遞質(zhì)的異常[14]。NCAM是細(xì)胞間黏附因子，在協(xié)調(diào)神經(jīng)肌肉的發(fā)展中具有顯著作用。NCAM在平滑肌細(xì)胞增殖時(shí)呈高表達(dá)，其表達(dá)下降主要在細(xì)胞突觸與神經(jīng)末梢之間建立成熟聯(lián)系后[15-16]。研究結(jié)果顯示，觀察組狹窄段的神經(jīng)叢中MCAM的表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組（弱陽(yáng)性），且腸神經(jīng)的異常分布沿著腸段下行而減少，NCAM表達(dá)漸趨正常，表明神經(jīng)、平滑肌細(xì)胞分化不完全，影響神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)肌肉的正常傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致腸管功能的異常，此時(shí)神經(jīng)組織的未分化成熟程度主要通過(guò)NCAM體現(xiàn)。分析HE染色后腸段肌間神經(jīng)叢中神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的情況，觀察組狹窄段未見(jiàn)該細(xì)胞，從移行段開(kāi)始可見(jiàn)且隨著遠(yuǎn)離該段神經(jīng)叢及叢中神經(jīng)節(jié)細(xì)胞都朝著正常計(jì)數(shù)恢復(fù)，對(duì)照組與觀察組距擴(kuò)張段遠(yuǎn)端8 cm處差異已不明顯，這對(duì)確定手術(shù)切除范圍具有參考價(jià)值，如果病變部位切除不到位則極有可能導(dǎo)致預(yù)后不良、術(shù)后復(fù)發(fā)。研究中觀察組腸管均肥厚，尤其以環(huán)肌層明顯，且環(huán)、縱肌層厚度比例失調(diào)，盡管在距擴(kuò)張段遠(yuǎn)處8 cm處也未恢復(fù)正常。在環(huán)、縱肌層出現(xiàn)了不同程度的空泡樣變，研究表明，空泡樣變的形成與炎癥、水腫相關(guān)，細(xì)胞毒素的暴露將加強(qiáng)空泡化。

表3 兩組Syn神經(jīng)纖維分布密度比較 例

表4 兩組NCAM神經(jīng)纖維分布密度比較 例

綜上，HD的不同腸段神經(jīng)、平滑肌的病變情況能夠作為根治術(shù)切除范圍的參考，但合理性仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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