KHOO YEW LEE，周 逸 ，張 俐 ，2

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122；2.廈門(mén)醫(yī)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361023）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是臨床常見(jiàn)的關(guān)節(jié)病，以關(guān)節(jié)軟骨病變?yōu)樘卣鳎P(guān)節(jié)屈伸不利等為臨 床 表 現(xiàn)［1］， 其 中 膝 骨 關(guān) 節(jié) 炎 （knee osteoarthritis，KOA）危害性最大，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)無(wú)法正常運(yùn)動(dòng)［2］，致殘率高達(dá) 53%［3］。 據(jù)國(guó)內(nèi)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，KOA患者以年齡55歲居多，60歲以上患者占老年人群里約85%［4-5］，隨著年齡遞增，發(fā)病率越高。前期研究表明：KOA與女性絕經(jīng)后雌激素水平的改變密切相關(guān)，勞損是KOA的重要誘因之一［3］。KOA的女性患者也隨著年齡、生理及病理改變而逐年增加［6］。本實(shí)驗(yàn)建立6月齡去卵巢鼠勞損性膝骨關(guān)節(jié)炎模型，模擬臨床老年女性膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生后，探討 E2、MMP-13、TNF-α 與軟骨退變的相關(guān)性，為臨床防治本病提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6月齡SPF級(jí)SD雌性大鼠24只，體質(zhì)量（438±21）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證書(shū)號(hào)：SCXK（滬）2012-0002，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，合格證號(hào)：2009-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 石蠟切片機(jī)（HM315，美國(guó)Thermo公司）；生物組織攤烤片機(jī)（YT-7FB，湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；高速離心機(jī)（HC-2514，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；CAVALLO烤箱 （中山佳威路家用電器有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9023A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；大鼠跑步臺(tái)（ZH-PT，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）；TECAN INFINITE M200PRQ多功能型酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；DMI 4000B型生物倒置顯微鏡（德國(guó)Leica公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 硫酸慶大霉素注射液8萬(wàn)U（福州海生福王制藥有限公司）；0.9%氯化鈉（福州沃森生物技術(shù)有限公司）；ELISA大鼠血清 E2試劑盒、ELISA大鼠關(guān)節(jié)液TNF-α試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；伊紅染色液、Cole氏蘇木素染色液、正常非免疫山羊血清（北京索萊寶科技有限公司）；即用型免疫組織化學(xué)UltraSensitiveTM SP試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；MMP13 Rabbit Polyclonal antibody抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及模型制備 將24只6月齡SD雌性大鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組、去卵巢組和去卵巢＋跑步組各8只。對(duì)照組予常規(guī)飼養(yǎng)；去卵巢組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)；去卵巢＋跑步組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)＋大鼠跑臺(tái)做跑步疲勞訓(xùn)練。雙側(cè)卵巢切除術(shù)操作方法：每只大鼠按3 mL／kg劑量腹腔注射10%水合氯醛溶液使大鼠麻醉；麻醉后以8%的硫化鈉溶液對(duì)大鼠劍突至下腹部行脫毛處理；脫毛后，沿前正中線用碘伏消毒，打開(kāi)腹腔以4號(hào)手術(shù)線結(jié)扎輸卵管上段，再去除雙側(cè)卵巢及輸卵管；術(shù)后于腹腔滴入1 mL青霉素（8萬(wàn)U）水溶液，關(guān)腹縫合并常規(guī)飼養(yǎng)［7］。去卵巢＋跑步組大鼠雙側(cè)卵巢切除術(shù)后7 d進(jìn)行跑步疲勞訓(xùn)練，使用大鼠跑步臺(tái)做跑步疲勞訓(xùn)練，訓(xùn)練設(shè)定均度15 m／min，行動(dòng)物適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)期2 d；隨后改變均速為30 m／min，間隔5 min，2 次 ／d，上坡坡度為 16°，連續(xù)訓(xùn)練 35 d［6］。

2.2 取材 造模5周后，于取材室將大鼠以10%水合氯醛水溶液0.3 mL／100 g行腹腔內(nèi)麻醉后予以下操作：① 沿腹中線切開(kāi)腹腔，鈍性游離臟器，暴露腹主動(dòng)脈，以采血針與腹主動(dòng)脈約15°刺入腹主動(dòng)脈，再將另一頭連接抗凝管，采集腹主動(dòng)脈血后靜置1～2 h，再予離心機(jī)以3 000 rmp離心20 min，取血上清液，于－80℃凍存。行腹主動(dòng)脈抽血后處死大鼠。② 關(guān)節(jié)液采集：取1 mL注射器1支，抽取超純水0.1 mL，經(jīng)髕上囊注入右膝關(guān)節(jié)腔，充分屈伸活動(dòng)膝關(guān)節(jié)；再以l mL注射器再次抽取超純水0.2 mL，沿髕骨上緣小切口打開(kāi)關(guān)節(jié)囊，經(jīng)切口輕輕灌洗，回抽數(shù)次后，充分抽回關(guān)節(jié)液里的稀釋液，轉(zhuǎn)移至EP管，離心機(jī)3 000 rmp離心20 min，取上清液，置入液氮箱冷凍保存，再轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱凍存。③剝離周圍肌肉筋膜組織后，取左側(cè)膝關(guān)節(jié)固定于4%多聚甲醛，行組織形態(tài)學(xué)觀察。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1 左側(cè)膝關(guān)節(jié)HE染色 將雌性大鼠左側(cè)膝關(guān)節(jié)取下，用4%多聚甲醛固定48 h后續(xù)用備制好的脫鈣液（10%EDTA）脫鈣6周。再以針灸針穿刺膝關(guān)節(jié)及股骨、脛骨等標(biāo)本，針刺無(wú)明顯阻力時(shí)即可確定為脫鈣成功。脫鈣成功后，石蠟包埋組織并切片（6 μm），以蘇木素-伊紅（HE）染色，采用生物倒置顯微鏡觀察對(duì)比3組形態(tài)學(xué)改變。對(duì)其組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)及潮線的完整性進(jìn)行膝關(guān)節(jié)軟骨的Mankin 評(píng)分及分級(jí)［8］：0～2 分為正常軟骨，3～5 分為軟骨表面纖維化，6～7分為中度軟骨損傷，8～10為重度軟骨損傷，10分以上為軟骨完全缺失。

2.3.2 膝關(guān)節(jié)MMP-13表達(dá) 免疫組化檢測(cè)標(biāo)本制備：膝關(guān)節(jié)石蠟包埋組織并切片（4 μm）后，常規(guī)脫蠟至水。以緩沖液洗3 min 2次，降低內(nèi)源性過(guò)氧化物酶造成的非特異性背景染色，再滴加一抗工作液，37℃孵育1～2 h。緩沖液洗 5 min 2次，滴加Primary Antibody Enhancer，在室溫下孵育20 min。緩沖液洗 5 min 2次，滴加 HRP Polymer（酶標(biāo)二抗）后以自來(lái)水充分沖洗、蘇木素復(fù)染、脫水、透明直至封片。并以DMI 6000+型生物倒置顯微鏡觀察MMP-13的表達(dá)情況，采用Image-Pro plus 6.0圖像分析軟件，分析高倍鏡下（10×40倍）拍攝的圖片并選定單位面積，進(jìn)行圖標(biāo)定量分析。

2.3.3 血清E2濃度 3組雌性大鼠腹主動(dòng)脈血充分解凍后，采用酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)法，檢測(cè)血清中E2濃度。

2.3.4 膝關(guān)節(jié)液中TNF-α的濃度 關(guān)節(jié)液充分解凍后，離心機(jī)以3 000 rmp，再次離心20 min，吸取上清液，采用酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)法，檢測(cè)右膝關(guān)節(jié)液中TNF-α的濃度。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 HE染色 對(duì)照組軟骨中的基質(zhì)染色均勻，潮線清晰可見(jiàn)，軟骨中層細(xì)胞無(wú)簇集現(xiàn)象且排列整齊，軟骨表層光滑無(wú)損；去卵巢組軟骨表層粗糙，細(xì)胞簇集及明顯凋亡缺失，潮線變得模糊，軟骨基質(zhì)染色改變；去卵巢+跑步組軟骨表層粗糙、皺褶及裂隙，細(xì)胞仍有缺失，潮線模糊，軟骨基質(zhì)染色改變，中層細(xì)胞開(kāi)始不同程度地增殖。見(jiàn)圖1。

圖1 3組大鼠左膝關(guān)節(jié)軟骨HE染色圖（×200）

3.2 3組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分比較 見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分比較（x±s） 分

3.3 3組大鼠膝關(guān)節(jié)MMP-13免疫組化情況比較免疫組化SP技術(shù)DAB顯色結(jié)果：陰性片無(wú)表達(dá)；對(duì)照組MMP-13表達(dá)較少；去卵巢組MMP-13表達(dá)量增加；去卵巢＋跑步組MMP-13表達(dá)量最為顯著。見(jiàn)圖 2、表 2。

圖2 3組大鼠膝關(guān)節(jié)MMP-13表達(dá)免疫組化圖（×400）

表2 3組大鼠膝關(guān)節(jié)MMP-13陽(yáng)性目標(biāo)積分光密度值比較（x±s）

3.4 3組大鼠血清中E2、膝關(guān)節(jié)液TNF-α濃度比較 見(jiàn)表3。

表 3 3組大鼠血清中E2、膝關(guān)節(jié)液 TNF-α 濃度比較（x±s）pg／mL

4 討論

絕經(jīng)后女性骨關(guān)節(jié)炎的患病率較高，因雌激素的下降可作用于軟骨中的炎癥因子，參與軟骨細(xì)胞代謝、基質(zhì)合成及分解，與女性膝骨關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生關(guān)聯(lián)［6，10］。 研究 絕經(jīng)后膝骨 關(guān)節(jié)炎的生理、病理關(guān)系中，選用動(dòng)物模擬模型做實(shí)驗(yàn)是較安全的方法。動(dòng)物造模方法較多［6］，本實(shí)驗(yàn)選擇了不受任何外界干預(yù)而產(chǎn)生膝關(guān)節(jié)病變的模型［11］進(jìn)行研究探討E2、MMP-13、TNF-α 的相關(guān)性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，去卵巢組和去卵巢＋跑步組Mankin評(píng)分、膝關(guān)節(jié)MMP-13表達(dá)、關(guān)節(jié)液TNF-α濃度均明顯提高（P＜0.01），血清E2濃度明顯降低（P＜0.01），且以去卵巢＋跑步組變化最為顯著。由此可見(jiàn)，膝關(guān)節(jié)軟骨嚴(yán)重缺損時(shí)Mankin評(píng)分越高，而血清E2水平則越低，提示E2水平檢測(cè)結(jié)果與Mankin評(píng)分兩者存在負(fù)相關(guān)性，E2水平的下降與膝關(guān)節(jié)軟骨損傷及炎癥的發(fā)生具有共同的發(fā)病機(jī)理，且存在一定的相關(guān)性［12-13］。E2可抑制TNF-α炎性因子的釋放，從而減少炎癥的發(fā)生［14-15］，E2下降則 TNF-α 的濃度升高。 MMP-13是近年來(lái)學(xué)者研究膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的重要指標(biāo)之一，其在膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中存在高表達(dá)，是關(guān)節(jié)軟骨退變的主要因素，MMP-13表達(dá)的增減與其受損的程度密切相關(guān)［16-17］。本實(shí)驗(yàn)中去卵巢＋跑步組也存在MMP-13在關(guān)節(jié)軟骨中存在持續(xù)高表達(dá)狀態(tài)［18］，證明 E2與MMP-13均參與了關(guān)節(jié)軟骨的完整性、炎癥的發(fā)生及其退變的過(guò)程，提示了雌激素和軟骨退化具有一定的相關(guān)性，這為絕經(jīng)老年女性膝關(guān)節(jié)炎發(fā)病的研究提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和依據(jù)。

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