林 潔 ，吳廣文 ，付長龍 ，洪秀娥 ，李 俐 ，林秋祥 ，吳明霞

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種常見老年性多發(fā)疾病，發(fā)病部位常見于膝關(guān)節(jié)，表現(xiàn)為疼痛、腫脹、活動受限等，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［1］。OA在中醫(yī)學(xué)上屬“痹證”范疇，以肝腎虧虛為病變根本，風(fēng)寒濕邪是其致痹外因，病機(jī)總屬本虛標(biāo)實、本痿標(biāo)痹［2-3］。電針作為傳統(tǒng)針灸療法與現(xiàn)代電療結(jié)合產(chǎn)物，具有舒經(jīng)活絡(luò)、行氣活血、消炎鎮(zhèn)痛之效，對防治OA具有良好療效［4-5］。前期研究表明：電針具有抑制軟骨細(xì)胞凋亡、延緩OA關(guān)節(jié)軟骨退變、促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的作用［6-8］。本實驗擬觀察電針刺激大鼠內(nèi)外膝眼一定時間后獲得的血清（電針后血清）對TNFα誘導(dǎo)的大鼠體外軟骨細(xì)胞凋亡模型的影響，并檢測其 Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun 基因表達(dá)情況，從而進(jìn)一步闡明電針防治OA的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實驗動物 2月齡SD雄性大鼠30只、4周齡SD雄性大鼠12只購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，合格證號：SCXK（滬）2012-0002。實驗動物飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，使用許可證號：SYXK（閩）2014-0005，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。

1.2 實驗試劑 磷酸鹽緩沖液（PBS）、低糖型DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、二型膠原酶、0.25%胰蛋白酶（美國 Hyclone公司）；腫瘤壞死因子 α（TNFα，美國Sigma 公司）；Annexin V-FITC／PI凋亡試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TAKARA公司）；PCR引物 （上海鉑尚生物技術(shù)有限公司）；諾唯贊qPCR SYBR Green Master Mix（南京諾唯贊生物科技有限公司）。

1.3 實驗儀器 華佗牌SD-Ⅱ型電子針療儀、華佗牌一次性不銹毫針，規(guī)格：13 mm×0.25 mm（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)公司）；CO2培養(yǎng)箱（香港力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；相差倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；PCR儀 （美國 Applied Biosystems公司）；7500 Fast型熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

2 實驗方法

2.1 血清制備 2月齡SD雄性大鼠30只，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組（n＝10）、電針15 min組（n＝10）和電針 30 min 組（n＝10）。 正常組常規(guī)飼養(yǎng)，電針15 min組和電針30 min組分別予電針刺激大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)、外膝眼，刺激時間分別為每次15 min、30 min，每天 1次，連續(xù)干預(yù) 1周。1周后，大鼠在麻醉狀態(tài)下行腹主動脈采血，經(jīng)離心獲取正常組、電針15 min組和電針30 min組血清，于56℃水浴滅活30 min及過濾除菌后，-20℃保存，細(xì)胞實驗時用DMEM配制為10%濃度進(jìn)行干預(yù)。

2.2 軟骨細(xì)胞提取與培養(yǎng) 采用2%戊巴比妥鈉麻醉4周齡SD大鼠，每次4只，分3批次提取軟骨細(xì)胞。用剪刀離斷并取出雙膝關(guān)節(jié)，在潔凈臺上，分離、切取雙膝軟骨，剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小后，用4 mL 2%Ⅱ型膠原酶于37℃培養(yǎng)箱消化2 h；消化后，收集上清液于15 mL離心管中，以1 000 rpm的速度離心5 min獲得軟骨細(xì)胞；用4 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸軟骨細(xì)胞沉淀，并接種25 cm3培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。上述步驟重復(fù)4次。于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞每日生長情況，待細(xì)胞長滿至85%～90%后傳代培養(yǎng)，每隔48 h后更換培養(yǎng)液。以2代軟骨細(xì)胞為實驗對象，調(diào)整細(xì)胞密度為 1×105個／mL，取 2 mL接種于六孔板中，培養(yǎng)72 h后進(jìn)行實驗。

2.3 軟骨細(xì)胞干預(yù)方法 參考文獻(xiàn)［9］，采用10 ng／mL TNFα誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。將第2代軟骨細(xì)胞隨機(jī)分為正常組、模型組、電針15 min組和電針30 min組。正常組予正常組血清2 mL干預(yù)，模型組予含10 ng／mL TNFα正常組血清2 mL干預(yù)，電針15 min組予含10 ng／mL TNFα電針15 min組血清2 mL干預(yù)，電針 30 min組予含10 ng／mL TNFα電針30 min組血清2 mL干預(yù)。各組同時進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)48 h后檢測相應(yīng)指標(biāo)。

2.4 檢測指標(biāo)

2.4.1 軟骨細(xì)胞凋亡率 干預(yù)軟骨細(xì)胞后，用移液槍吸棄培養(yǎng)液，PBS清洗1次，吸棄PBS，用不含EDTA的胰酶消化軟骨細(xì)胞，收集于流式管中，2 000 rpm離心5 min，調(diào)整細(xì)胞密度為1～5×105個／mL。流式管每管加入500 μL Binding Buffer重懸軟骨細(xì)胞，再加入FITC和PI各5 μL，混勻并于室溫避光孵育15 min，用流式細(xì)胞儀檢測各組軟骨細(xì)胞凋亡率。

2.4.2 軟骨細(xì)胞 Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun 基因表達(dá) 如2.3干預(yù)軟骨細(xì)胞后，用Trizol法提取各組軟骨細(xì)胞總RNA，取1 μg RNA按照TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照諾唯贊qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒說明書進(jìn)行操作，以各組cDNA為模板行實時熒光定量PCR檢測，β-actin為內(nèi)參，具體引物序列如下：

表1 引物序列表

實驗反應(yīng)分為三個階段：預(yù)熱階段為95℃3 min； 循環(huán)階段為 95℃ 10 s、60℃ 30 s， 循環(huán) 40次；溶解曲線階段為 95℃ 15 s、60℃ 30 s、95℃ 15 s。實驗結(jié)束后，采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計分析。計量資料屬正態(tài)分布的以（x±s）表示，采用t檢驗；不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗。

3 實驗結(jié)果

3.1 軟骨細(xì)胞形態(tài)觀察 剛提取的軟骨細(xì)胞 （即原代軟骨細(xì)胞）懸浮于培養(yǎng)液中（圖1A），原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)24 h后開始貼壁，培養(yǎng)48 h可見軟骨細(xì)胞成簇現(xiàn)象（圖1B），以梭形或橢圓形生長。細(xì)胞數(shù)量較多時，可呈典型的“鋪路石”狀。第1代及第2代軟骨細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞的增殖速度較快，增殖及分泌基質(zhì)的能力較強(qiáng)，其中第2代軟骨細(xì)胞較為純化，更適合作為實驗對象（圖1C、圖1D）。

3.2 各組軟骨細(xì)胞凋亡率 電針后血清對TNFα誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的影響如圖2所示，正常組凋亡率為（6.22±0.13）%，模型組凋亡率為（26.49±0.79）%，2組比較有顯著性差異 （P＜0.05）。 電針15 min組凋亡率為（16.81±1.71）%，電針 30 min組凋亡率為（13.88±0.83）%，2組與模型組比較均有顯著性差異（P均＜0.05）。

圖1 軟骨細(xì)胞形態(tài)觀察（×100）

3.3 軟骨細(xì)胞 Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun 基因表達(dá)與正常組比較，模型組在 Erk1 ／2、C-Myc、CFos、C-Jun 表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，電針 15 min組與電針 30 min組的 Erk1／2、CMyc、C-Fos、C-Jun基因表達(dá)均顯著降低（P均＜0.05）。 見表 2、圖 3。

4 討 論

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated proyein kinases，MAPKs）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多細(xì)胞內(nèi)，

圖2 各組軟骨細(xì)胞凋亡情況

圖3 各組軟骨細(xì)胞 Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun基因表達(dá)情況

表 2 各組軟骨細(xì)胞 Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun 基因表達(dá)結(jié)果（x±s）

其將細(xì)胞外刺激轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，引起細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)反應(yīng)。目前，在哺乳類細(xì)胞已發(fā)現(xiàn)存在著 ERK通路、JNK／SAPK通路、P38 MAPK通路三條并行的MAPKs信號通路。近年來，ERK通路（即Ras-Raf-MEK-ERK信號連級通路）的細(xì)胞生物學(xué)作用越來越受到重視，有學(xué)者認(rèn)為ERK通路表達(dá)上調(diào)一方面能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，形成明顯骨贅，另一方面可能會加快軟骨細(xì)胞凋亡，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞外基質(zhì)降解［10-11］。該信號通路可被多種細(xì)胞外刺激信號激活，激活的Erk1／2進(jìn)一步促使C-Myc、C-Fos、C-Jun轉(zhuǎn)錄因子磷酸化來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡［12-13］。 相關(guān)研究表明：C-Myc、C-Fos、C-Jun 參與多種細(xì)胞凋亡活動［14-17］。此外有研究顯示：TNFα能激活Ras-Raf-MEK-ERK信號通路，促進(jìn)IL-1β表達(dá)，提高M(jìn)MPs活性，并與激活產(chǎn)物進(jìn)一步發(fā)生協(xié)同作用，促使細(xì)胞外基質(zhì)降解、軟骨細(xì)胞凋亡［18-20］。

本實驗結(jié)果顯示：TNFα誘導(dǎo)的大鼠凋亡軟骨細(xì)胞經(jīng)其電針后血清干預(yù)后，細(xì)胞凋亡率明顯下降，各組軟骨細(xì)胞 Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun 的基因表達(dá)顯著降低，表明大鼠電針后血清能有效抑制TNFα誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun 基因的表達(dá)有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ CHEN W H，LIU X X，TONG P J，et al.Diagnosis and management of knee osteoarthritis Chinese medicine expert consensus（2015） ［J］.Chin J Integr Med，2016，22（2）：150-153.

［2］李西海，劉獻(xiàn)祥.骨關(guān)節(jié)炎的核心病機(jī)——本痿標(biāo)痹［J］.中醫(yī)雜志，2014，55（14）：1248-1249，1252.

［3］ 鄭春松，嚴(yán)培晶，付長龍，等.從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度探討骨關(guān)節(jié)炎方證對應(yīng)研究的思路與方法［J］.福建中醫(yī)藥，2016，47（6）：49-51.

［4］ 林潔，付長龍，李俐，等.電針治療膝骨性關(guān)節(jié)炎療效的系統(tǒng)評價［J］.康復(fù)學(xué)報，2016，26（4）：52-58.

［5］ 謝汶樺，莊松華，周曉霞.電針加正清痛寧離子導(dǎo)入治療急性期腰椎間盤突出癥 49 例［J］. 福建中醫(yī)藥，2017，48（2）：16-17.

［4］ WU M X，LI X H，LIN M N，et al.Clinical study on the treatment of knee osteoarthritis of Shen-Sui insufficiency syndrome type by electroacupuncture ［J］.Chin J Integr Med，2010，16（4）：291-297.

［5］ 吳明霞，李西海，李俐，等.電針對骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞JAKSTAT信號通路表達(dá)的影響［J］.福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，21（6）：21-23.

［6］ 吳明霞，李西海，李俐，等.電針后血清對TNF-α誘導(dǎo)凋亡軟骨細(xì)胞 MAPK 信號通路的影響［J］.福建中醫(yī)藥，2011，42（6）：43-45.

［7］ 陳后煌，邵翔，李俐，等.腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞凋亡模型的建立及鑒定［J］.中國組織工程研究，2017，21（4）：527-531.

［8］ 陳澤華，李楠.ERK1／2信號通路與骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞活性及其治療的相關(guān)性研究［J］. 風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2015，4（1）：63-65，71.

［9］ 陳澤華，林海英，李楠.綜述細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1／2信號通路與肝腎虧虛型膝骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2015，30（9）：3207-3210.

［10］ ROSKOSKI R J.ERK1／2MAP kinases：structure function，and regulation ［J］.Pharmacol Res，2012，66（2）：105-143.

［11］潘偉東，王東軍.ERK1／2研究進(jìn)展及其與神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)性［J］.海南醫(yī)學(xué)，2011，22（22）：121-124.

［12］王寧，龍迪，孟曉娜.IL-1β對小鼠軟骨細(xì)胞中c-myc蛋白表達(dá)的影響［J］.中華臨床醫(yī)師雜志（電子版） ，2013，7（24）：11486-11490.

［13］黃宏艷，肖曉山，周代偉.硝普鈉控制性降壓對兔腦神經(jīng)元cfos及細(xì)胞凋亡的影響［J］. 臨床麻醉學(xué)雜志，2011，27（8）：809-811.

［14］葉冬青，高維娟.c-jun氨基末端激酶信號通路與細(xì)胞凋亡［J］.中國老年學(xué)雜志，2009，29（7）：894-896.

［15］ YU R A，YANG C F，CHEN X M.DNA damage，apoptosis and C-myc，C-fos，and C-jun overexpression induced by selenium in rat hepatocytes ［J］.Biomed Environ Sci，2006，19（3）：197-204.

［16］ GOMEZ R，CONDE J，SCOTECE M，et al.Endogenous cannabinoid anandamide impairs cell growth and induces apoptosis in chondrocytes［J］.J Orthop Res，2014，32（9）：1137-1146.

［17］羅玉明，鄭維篷，魏合偉.骨關(guān)節(jié)炎與細(xì)胞因子TNF-α、IL-6關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代診斷與治療，2013，24（2）：326-327.

［18］龔元勛，馬駿，王述菊，等.細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶與腫瘤壞死因子-α 的研究進(jìn)展［J］.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2014，53（9）：138.