李曉春，郝銀恒，柳長(zhǎng)明

1.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007； 2.河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 洛陽(yáng) 471000； 3.深圳市第七人民醫(yī)院，廣東 深圳 518000

胃癌(gastric cancer)是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在發(fā)展中國(guó)家胃癌發(fā)生率比較高，占世界胃癌總發(fā)生率的67%左右[1]。如今人們認(rèn)識(shí)到胃癌同其他惡性腫瘤一樣是一種分子疾病，因此，從凋亡途徑來(lái)探究胃癌的發(fā)生與發(fā)展具有一定的研究?jī)r(jià)值。具有腫瘤特異性的凋亡抑制基因家族成員BIRC5一般情況下只表達(dá)于腫瘤組織和胚胎組織[2-3]，資料顯示，胃癌腫細(xì)胞中BIRC5呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，而在正常分化組織中幾乎不表達(dá)，與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有著密不可分的關(guān)系[4]。人絲氨酸/精氨酸富有剪接因子1(serine/arginine rich splicing factor 1，SRSF1)是SR蛋白家族的原型成員，它亦是一種原癌蛋白，在乳腺癌、白血病及肺癌等惡性腫瘤的患者體內(nèi)中呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)現(xiàn)象[5]。學(xué)者認(rèn)為，SRSF1之所以參與多種復(fù)雜的生物學(xué)通路取決于其對(duì)前體mRNA的選擇性剪接與加工、胞內(nèi)定位與運(yùn)輸?shù)壬磉^(guò)程，從某種程度上控制著下游相關(guān)蛋白的表達(dá)程度及功能的發(fā)揮。研究表明，SRSF1與BIRC5在前列腺癌腫組織中均有高表達(dá)，BIRC5蛋白表達(dá)量的升高與SRSF1蛋白表達(dá)量的升高呈正相關(guān)[6]；然而關(guān)于SRSF1和BIRC5在胃癌中表達(dá)的相關(guān)研究很少，本研究旨在通過(guò)RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)兩基因在胃癌腫組織及其癌旁組織中的表達(dá)情況，進(jìn)而探究?jī)烧吲c胃癌發(fā)生、發(fā)展之間可能存在的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1一般材料 留取60例2016年5月至2017年5月于我院(佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院)普通外科進(jìn)行胃癌切除患者的癌腫標(biāo)本及其相應(yīng)的癌旁組織，留取的癌旁組織距離其癌腫邊緣均大于50 mm。標(biāo)本均存儲(chǔ)于液氮中備用。本研究始終遵循中華醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)制定的倫理標(biāo)準(zhǔn)，患者術(shù)前通過(guò)影像學(xué)檢查、血液學(xué)檢查均未發(fā)現(xiàn)其他系統(tǒng)惡性腫瘤，術(shù)前未行放療、化療、射頻治療及免疫治療，術(shù)中所選標(biāo)本病理回報(bào)確認(rèn)為胃癌。60例胃癌患者的胃癌標(biāo)本中，男性32例，女性28例；年齡在40～86歲，平均59.7歲；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期37例，Ⅲ～Ⅳ期23例；術(shù)中證實(shí)有淋巴轉(zhuǎn)移者15例，否認(rèn)淋巴轉(zhuǎn)移者45例。

1.2檢測(cè)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)試劑 鼠抗人單克隆SRSF1抗體及β-actin抗體(購(gòu)自福建邁新)，BIRC5、SRSF1及內(nèi)參引物(Bioengineering公司合成)。提取RNA Kit、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(QIAGENE公司，Germany)，Taq DNA聚合酶及dNTPs購(gòu)自TaKaRa。BIRC5(sc-101432)、SRSF1(sc-33652)抗體、Actin(sc-10731)及HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(sc-2005)購(gòu)自Santa Cruz。ECL Plus western blotting detection reagents(RPN2132，GE，Piscotoway，NJ，USA)，X光膠片(Eastman Kodak Co.)。

1.2.2總RNA提取 參照miRNeasy Mini Kit提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行mRNA和microRNA的總RNA提取。

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) SRSF1 mRNA、BIRC5 mRNA cDNA，均采用Invitrogen的SuperScriptTMFirst-strand Synthesis System進(jìn)行合成，引物為oligo-dt。采用Invitrogen的SuperScriptTMII試劑盒，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟操作mRNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA。將所有產(chǎn)物存儲(chǔ)于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4半定量PCR法 參照文獻(xiàn)[7]BIRC5及SRSF1的PCR擴(kuò)增，應(yīng)用miScript SYBR Green PCR試劑盒三步法。SRSF1擴(kuò)增時(shí)無(wú)需加入miScript通用引物。BIRC5及SRSF1的PCR擴(kuò)增引物：SRSF1 sense：5′-CGTTGAGTTCGAGGACC-CG-3′，SRSF1 Anti-sense：5′-TAACCCGGATGT-AGGCAG-3′，BIRC5 sense：5′-ATGGGTGCCCC-GACGT-3′，BIRC5 Antisense：5′-ACAGCAGTG-AGTCTGTC-3′，內(nèi)參為β-actin：Sense：5-CTGA-CAGACTACCTCATGAAG-3，Antisense：5-TCA-ATCCATGGCAGC-3，反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃、5 min；變性94℃、30 s，退火60℃、30 s，72℃、30 s，延伸72℃、7 min，30個(gè)循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)最終產(chǎn)物。

1.2.5應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)SRSF1及BIRC5蛋白表達(dá)強(qiáng)度 參照說(shuō)明書(shū)的提示提取組織總蛋白，完成蛋白濃度測(cè)定：取50 μg蛋白，與6×loading buffer混合后，65℃水浴10 min。12% SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)PVDF膜上，PVDF膜在5%脫脂奶粉35℃封閉60 min。經(jīng)TBST充分洗膜后，與anti-SRSF1抗體(1∶500)，anti-BIRC5 antibody(1∶400)室溫孵育60 min，TBST buffer洗膜3次，共15 min，與HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育60 min，TBST buffer充分漂洗3次，每次5 min。采用ECL plus western blotting detection reagents使膠片進(jìn)行曝光。以β-actin作為內(nèi)參照，SRSF1/β-actin比值、BIRC5/β-actin即為蛋白表達(dá)強(qiáng)度。

2 結(jié) 果

2.1SRSF1和BIRC5在胃癌腫組織中的表達(dá)情況及臨床病理特征之間的關(guān)系 在胃癌腫組織中SRSF1的表達(dá)情況：SRSF1陽(yáng)性表達(dá)率為75.0%(45/60)，明顯高于其癌旁組織的8.3%(5/60)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=46.5103，P=0.000)；BIRC5 mRNA的表達(dá)情況：BIRC5陽(yáng)性表達(dá)率為81.7%(49/60)，高于癌旁組織中的11.7%(7/60)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=39.1152，P=0.000)；胃癌腫組織中SRSF1 mRNA與BIRC5 mRNA的陽(yáng)性表達(dá)盡管與其患者所處的年齡階段、性別差異以及腫瘤大小等因素?zé)o關(guān)，但是癌腫組織的分化程度、淋巴結(jié)是否發(fā)生轉(zhuǎn)移以及TNM分期都與之有著密不可分的關(guān)聯(lián)(見(jiàn)圖1、圖2，表1)。

N1、N2、N3:癌旁組織，C1、C2、C3:癌組織；胃癌組織和癌旁組織中SRSF1統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：胃癌組織/癌旁組織=3.3倍

圖1胃癌患者SRSF1 mRNA表達(dá)分析

N1、N2、N3:癌旁組織，C1、C2、C3:癌組織；胃癌組織和癌旁組織中BIRC5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：胃癌組織/癌旁組織=2.48倍

圖2 胃癌患者BIRC5 mRNA表達(dá)分析

2.2SRSF1和BIRC5在胃癌組織中的關(guān)系 在存留的60例胃癌標(biāo)本中，SRSF1表達(dá)陽(yáng)性的有45例，陰性15例；BIRC5表達(dá)陽(yáng)性者49例，陰性11例；同一標(biāo)本中兩者均呈陽(yáng)性者有41例，陰性的有6例。SRSF1與BIRC5在胃癌腫組織中的陽(yáng)性表達(dá)正相關(guān)(r=0.3496，P=0.006<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 胃癌中SRSF1和BIRC5之間的關(guān)系

2.3SRSF1和BIRC5蛋白相對(duì)表達(dá)水平 在胃癌腫組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織內(nèi)均可見(jiàn)SRSF1和BIRC5的蛋白條帶；檢測(cè)分析其蛋白條帶灰度值后可見(jiàn)：胃癌腫組織中SRSF1的蛋白表達(dá)量相較于癌旁組織中蛋白的表達(dá)量明顯增高(t=44.87，P<0.01)；BIRC5蛋白在胃癌腫組織中表達(dá)量同樣比其在癌旁組織中的蛋白表達(dá)量高(t=69.34，P<0.01)；(圖3、圖4，表3)。

SRSF1蛋白表達(dá)分析(內(nèi)參β-actin)， N1、N2、N3:癌旁組織；C1、C2、C3:胃癌組織；胃癌組織和癌旁組織中SRSF1統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：；胃癌組織/癌旁組織=3.08倍

圖3胃癌患者SRSF1蛋白表達(dá)分析

BIRC5蛋白表達(dá)分析(內(nèi)參β-actin)， N1、N2、N3:癌旁組織；C1、C2、C3:胃癌組織；胃癌組織和癌旁組織中SRSF1統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；胃癌組織/癌旁組織=1.73倍

圖4 胃癌患者BIRC5蛋白表達(dá)分析

3 討 論

3.1研究結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在胃癌腫組織中SRSF1、BIRC5兩基因的表達(dá)相較于其癌旁組織均表現(xiàn)出異常增高，兩者存在正相關(guān)。臨床病理特征統(tǒng)計(jì)表明，胃癌腫組織中SRSF1 mRNA與BIRC5 mRNA的陽(yáng)性表達(dá)雖然與其患者所處的年齡階段、性別差異以及腫瘤大小等因素?zé)o關(guān)，但是與其癌腫組織的分化程度、淋巴結(jié)是否發(fā)生轉(zhuǎn)移以及TNM分期有關(guān)，進(jìn)一步證明了SRSF1與BIRC5的高表達(dá)有著促進(jìn)胃癌發(fā)生、發(fā)展的功能。

資料顯示，SRSF1過(guò)表達(dá)是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要因素[8-11]，其調(diào)節(jié)可變剪接事件已被證實(shí)有助于腫瘤發(fā)生[11]。過(guò)表達(dá)的SRSF1在Wnt-β-catnin信號(hào)通路中，是通過(guò)促進(jìn)基因剪接形成抗凋亡亞型，抑制細(xì)胞凋亡。SRSF1可以增強(qiáng)蛋白翻譯激活因子的磷酸化或者抑制蛋白翻譯的抑制因子這兩種方式同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖[2,12]。學(xué)者發(fā)現(xiàn)，SRSF1是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡程序，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，然而細(xì)胞的凋亡抑制則是促進(jìn)腫瘤迅速發(fā)生、發(fā)展的主要因素之一[6]。因此，不難斷定在正常組織細(xì)胞突變成異常增生細(xì)胞的過(guò)程中與細(xì)胞的凋亡抑制有著密不可分的聯(lián)系。BIRC5是凋亡抑制基因家族中新近發(fā)現(xiàn)的成員，在抑制細(xì)胞凋亡方面效果顯著，查閱基因庫(kù)可知BIRC5參與了人類(lèi)多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。從組織分布上來(lái)看BIRC5通常表達(dá)于胚胎和發(fā)育的胎兒組織，對(duì)于成人而言除胸腺、生殖腺外其他組織器官未見(jiàn)表達(dá)[13]。在腫瘤組織中 BIRC5呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，這與BIRC5是目前已知的作用較強(qiáng)的凋亡抑制蛋白有關(guān)[2-3]。有研究顯示SRSF1與BIRC5在前列腺癌腫組織中同時(shí)呈現(xiàn)高表達(dá)，并且BIRC5蛋白表達(dá)量的升高與SRSF1蛋白表達(dá)量的升高呈正相關(guān)[6]，可能與細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路中斷有關(guān)。目前，死亡受體途徑和線(xiàn)粒體途徑是細(xì)胞凋亡的兩條主要途徑，兩者均需要通過(guò)激活下游的效應(yīng)因子caspase-3及caspase-7來(lái)聯(lián)通信號(hào)通路，BIRC5蛋白則是直接粘附于活化的caspase-3、caspase-7上，使其不能發(fā)揮效能，信號(hào)通路由此中斷[3,14]。推測(cè)胃癌的發(fā)生、發(fā)展可能與過(guò)表達(dá)的SRSF1通過(guò)上調(diào)BIRC5的表達(dá)來(lái)阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)通路有關(guān)。

3.2研究意義 實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SRSF1和BIRC5基因的高表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在胃癌腫組織中SRSF1的高表達(dá)是促進(jìn)凋亡抑制基因BIRC5高表達(dá)的一個(gè)因素，這為我們通過(guò)干預(yù)SRSF1的表達(dá)進(jìn)而影響凋亡抑制因子BIRC5的表達(dá)來(lái)治療及預(yù)防胃癌復(fù)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)以及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3.3創(chuàng)新性 近年來(lái)從細(xì)胞凋亡途徑來(lái)探討腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究屢見(jiàn)不鮮，然而將選擇性剪接因子SRSF1與凋亡抑制因子BIRC5聯(lián)系在一起應(yīng)用于胃癌的研究則是屈指可數(shù)，該實(shí)驗(yàn)填充了這方面的空缺。

3.4不足與展望 由于實(shí)驗(yàn)條件的限制我們選取的標(biāo)本數(shù)量少，這意味著實(shí)驗(yàn)結(jié)論不一定適合于所有胃癌患者，因此在后續(xù)的研究中還需通過(guò)對(duì)臨床上大量胃癌標(biāo)本的研究來(lái)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)論。通過(guò)SRSF1和BIRC5的深入研究有望使其成為胃癌早期診斷的新標(biāo)準(zhǔn)，并且為臨床上治療及預(yù)防胃癌的復(fù)發(fā)提供新靶點(diǎn)。

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