吳曼曼，王佳，李娜，趙鑫，李新莉

大連醫(yī)科大學 生物技術(shù)系，遼寧 大連 116044

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是酒精攝入過量(急性)或長期酗酒(慢性)導致的中毒性肝損傷，初期常誘發(fā)脂肪肝，進而發(fā)展成酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化，最終導致肝功能衰竭[1]。由于腸—肝軸的存在，通過膽汁的分泌和肝臟血流的變化，腸道菌群的結(jié)構(gòu)與組成常常發(fā)生改變。酒精性肝損傷存在著腸道屏障的損害和腸道菌群的失衡，主要表現(xiàn)為侵入性細菌數(shù)量增加，保護性細菌數(shù)量減少，這種變化在某種程度上影響肝損傷的進程。Kirpich等[2]發(fā)現(xiàn)酒精性肝臟損傷患者腸道菌群結(jié)構(gòu)改變，雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量明顯減少，短期補充雙歧桿菌后肝臟轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶活力和總膽紅素含量降低；蔡夏夏等[3]研究表明酒精性肝損傷動物腸道菌群改變，出現(xiàn)肝臟脂肪變性及腸道上皮細胞屏障功能障礙等，通過補充天然活性成分能夠刺激雙歧桿菌等益生菌的生長，具有益生元的作用。大蒜素(allicin)是從蔥科植物大蒜中提取的具有生物活性的含硫化合物總稱，有特殊氣味，具有較好抗菌、調(diào)血脂、降血糖、抗腫瘤、抗衰老等功能[4]。大蒜素對酒精性肝損傷具有保護作用，其機制與清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物對膜結(jié)構(gòu)的損害有關(guān)[5]。本課題利用大蒜素對小鼠預防給藥30 d，使用56度紅星二鍋頭灌胃小鼠建立急性酒精性肝損傷模型，ERIC-PCR和PCR-DGGE技術(shù)研究大蒜素對急性酒精性肝損傷小鼠腸道菌群失調(diào)的預防作用，分析腸道菌群結(jié)構(gòu)的整體差異并鑒定優(yōu)勢條帶序列。以腸道菌群作為治療酒精性肝病的潛在作用靶點，初步探討大蒜素預防酒精性肝損傷的可能作用機制，為進一步開發(fā)保肝護肝藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 大蒜素(自制，產(chǎn)率7.27%，含量0.978%)；護肝片(長春海外制藥集團有限公司，批號：Z22020994，規(guī)格：0.35 g)；北京56度紅星二鍋頭(北京紅星股份有限公司)；糞便細菌DNA提取試劑盒(成都福際生物技術(shù)有限公司)；GC-341f(5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGC-GGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCA-G)，518r(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG)，ERIC-1(A-TGTAAGCTCCTGGGGATTCAC)，ERIC-2(AA-GTAAGTGACTGGGGTGAGCG)(英濰捷基上海貿(mào)易有限公司)；PCR-Mix(大連優(yōu)萌威貿(mào)易有限公司)，丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素、去離子甲酰胺、瓊脂糖、溴化乙錠(EB)(大連羽銘生物科技有限公司)；DL2000 Marker，DL100 Marker(大連寶生物工程有限公司)。

1.2儀器 UVS-1渦旋振蕩器(北京優(yōu)晟科技有限公司)，HC-3018R高速冷凍離心機(離心半徑6 cm)(安徽中科中佳科學有限公司)，JY-spat瓊脂糖水平電泳儀、DGGE電泳儀(大連競邁設備有限公司)。

1.3動物 SPF級KM小鼠，雌、雄各半，體重18～22 g，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(遼)2008-0002。

1.4方法

1.4.1分組與處理 護肝片和大蒜素分別溶于生理鹽水配成護肝片溶液(6 mg/mL)、大蒜素高濃度(200 mg/mL)和低濃度(50 mg/mL)溶液[6]。小鼠隨機分為正常對照組(N)、急性酒精性肝損傷組(A)、護肝片組(P)、大蒜素高(GH)、低濃度組(GL)，每組8只。除N組和A組，其他組灌服相應藥物0.2 mL 30 d，末次給藥30 min后，正常對照組灌服生理鹽水，其他組灌胃14 mL/kg紅星二鍋頭建立急性酒精性肝損傷模型，12 h后取每只小鼠糞便，于-80℃保存。

1.4.2糞便細菌DNA提取 使用試劑盒提取每只小鼠糞便細菌DNA，按說明書進行操作。

1.4.3PCR擴增 使用ERIC-PCR上、下游引物ERIC-1和ERIC-2，擴增體系(25 μL)為：2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，去離子水補充至25 μL。PCR程序：預變性94℃ 5 min；變性94℃ 50 s，退火49℃ 30 s，46℃ 30 s，延伸72℃ 3 min，35個循環(huán)；充分延伸72℃ 9 min。PCR擴增產(chǎn)品用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以2 000 bp Marker為參照。

1.4.4PCR-DGGE電泳 使用16S rRNA基因V3可變區(qū)上、下游引物GC-341f和518r，擴增體系同1.4.3。PCR程序：預變性94℃ 5 min；變性94℃ 30 s，退火54℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，30個循環(huán)；充分延伸72℃ 7 min。采用8%丙烯酰胺凝膠配制25%～50% DGGE變性梯度凝膠[其中100%濃度變性梯度凝膠含40%(v/v)去離子甲酰胺和7 mol/L尿素]，取10 μL PCR產(chǎn)物于DGGE膠，60℃、70 V電泳5 h，電泳后取出凝膠使用0.125‰ EB染色，拍照。

1.4.5差別條帶序列分析 切下DGGE圖譜中的優(yōu)勢條帶，加入20 μL無菌水搗碎，于95℃浸泡10 min，37℃過夜，取上清液作模板進行PCR擴增，引物為341f和518r，PCR反應體系和程序同1.4.4。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序，結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast對比分析。

1.5統(tǒng)計學處理 用Quantity One 4.6.2軟件對DGGE圖譜進行UPGMA聚類分析，用Matlab V7.0軟件對ERIC-PCR圖譜進行主成分PCA分析。

2 結(jié) 果

2.1EIRC-PCR圖譜分析 大蒜素對小鼠進行預防給藥30 d后建立急性酒精性肝損傷模型，腸道菌群ERIC-PCR指紋圖譜如圖1a所示。正常對照組(N1和N2)條帶較多，以小片段居多，兩條主要條帶集中在300 bp和500 bp附近，以300 bp左右的條帶強度最強。急性酒精性肝損傷模型組條帶數(shù)量減少，除大蒜素高劑量組(GH1和GH2)外，其他實驗組均以300 bp左右的條帶為優(yōu)勢條帶，而500 bp左右的條帶強度減弱。使用高濃度大蒜素對小鼠進行預防給藥，小鼠腸道中條帶數(shù)量基本不變，但是300 bp左右的條帶強度明顯減弱，500 bp左右的條帶強度有增加的趨勢。以上研究結(jié)果表明酒精建立急性肝損傷模型小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，300 bp和500 bp左右的條帶為急性酒精性肝損傷組和大蒜素預防給藥組小鼠腸道中的特征條帶。PCA分析(圖1b)結(jié)果顯示，A1、P1、GH2、GL1和GL2組分布于同一區(qū)域，距離較近，與正常組沿PC2方向顯著分開，這也表明急性酒精性肝損傷小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與正常組相比具有顯著差異。A1和A2組與其他實驗組沿PC1方向顯著分開，距離較遠，這表明急性酒精性肝損傷小鼠與使用護肝片和大蒜素預防組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)有差異。

2.2PCR-DGGE圖譜分析 大蒜素對小鼠預防給藥30 d后使用紅星二鍋頭建立酒精性肝損傷小鼠模型，腸道菌群DGGE圖譜如圖2a所示。同一位置的條帶代表相同的優(yōu)勢細菌，條帶亮度則反映出這一細菌的相對含量。N1、N2泳道條帶較多，且亮度較強，表明正常組小鼠腸道菌群的數(shù)量和含量均較高。而其他實驗組條帶數(shù)量有所減少，表明酒精導致的急性肝損傷小鼠腸道菌群的豐富度和多樣性減低。條帶a、b、c、d基本存在于各組樣品中為共有條帶，說明其所代表的細菌是小鼠腸道中的優(yōu)勢菌群，其中條帶a所代表的細菌在大蒜素高劑量組中含量最大。條帶g在N泳道中強度高，含量大，而在其他實驗組中含量明顯降低，這表明酒精導致急性肝損傷，小鼠腸道菌群種類發(fā)生改變，條帶g所代表的細菌是差異菌群。條帶e和f存在于泳道N1、N2和A1、A2中，而在護肝片和大蒜素長期干預組中含量很低，幾乎消失，這表明e和f所代表的細菌是長期服用護肝片或大蒜素的小鼠與對照組小鼠腸道差異菌群。UPGMA分析DGGE圖的相似性，結(jié)果顯示各組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)聚成兩大簇，急性酒精性肝損傷對照組聚成一簇，其他組聚成另一簇，兩大簇之間相似性較低，僅為0.54，表明酒精導致的急性肝損傷，對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)存在顯著影響。大蒜素高劑量組(GH1和GH2)與其他實驗組之前的相似性僅有0.57，表明長期灌服大蒜素對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)也有一定影響。

N：正常組，A：急性酒精性肝損傷組，P：護肝片組，GL：大蒜素低濃度組，GH：大蒜素高濃度組

圖1大蒜素對急性酒精性肝損傷小鼠腸道菌群ERIC-PCR圖譜(a)和PCA主成分分析結(jié)果(b)

N：正常組，A：急性酒精性肝損傷組，P：護肝片組，GL：大蒜素低濃度組，GH：大蒜素高濃度組

2.3差異條帶序列分析 DGGE圖譜優(yōu)勢條帶測序結(jié)果在GenBank中用Blast進行檢索和同源性比較，如表1所示。糞便細菌與數(shù)據(jù)庫已知細菌序列的相似性均在93%以上。

表1 DGGE圖譜中優(yōu)勢條帶測序與參比序列對照結(jié)果

由表1可知，菌a和g分別與砂優(yōu)桿菌和Eubacteriumplexicaudatum的相似性為96%和94%，兩者均為優(yōu)桿菌屬(Eubacterium)。菌b與維氏氣單胞菌的相似性為93%，菌c與Lactobacillusequicursoris的相似性為96%，菌d與牙齦卟啉單胞菌的相似性為100%，菌e與Enterococcussulfureus的相似性為97%，菌f與梭菌屬的相似性為97%。建立急性酒精性肝損傷模型小鼠腸道菌群失調(diào)，糞便標本中優(yōu)桿菌屬細菌明顯減少，Enterococcussulfureus等腸球菌和梭菌為正常小鼠腸道優(yōu)勢菌型，護肝片或大蒜素預防給藥30 d，以上2種細菌含量明顯減少。

3 討 論

3.1結(jié)果分析 ERIC-PCR圖譜和PCA分析表明正常小鼠腸道中菌群條帶較多，主要集中在300 bp和500 bp附近。除大蒜素高劑量預防給藥組外，其他急性酒精性肝損傷小鼠腸道中以300 bp左右的條帶為優(yōu)勢條帶，而500 bp左右的條帶強度減弱。大蒜素高劑量組小鼠腸道中300 bp左右的條帶強度較弱，500 bp左右的條帶強度有增加的趨勢。因此，推測300 bp和500 bp左右的條帶為急性酒精性肝損傷組和大蒜素干預組小鼠腸道中的特征條帶，可作為后續(xù)篩選酒精性肝損傷藥物的切入點。ERIC-PCR技術(shù)可以快速、靈敏地從分子水平比較分析微生物群落的結(jié)構(gòu)，從而實現(xiàn)對調(diào)節(jié)腸道菌群藥物的篩選，可是因為其通過DNA分子量來分離目標條帶，可能相同條帶包括多種細菌，ERIC-PCR只能簡單判斷樣品中微生物的分布趨勢。為明確腸道菌群優(yōu)勢條帶的序列及菌群結(jié)構(gòu)的整體差異，基于16S rRNA基因的PCR-DGGE技術(shù)被應用于研究大蒜素對急性酒精性肝損傷小鼠腸道菌群失調(diào)的預防作用，為開發(fā)利用大蒜素的生物活性提供一個新方向。實驗結(jié)果表明大蒜素預防給藥能夠增加腸道中優(yōu)桿菌屬細菌的數(shù)量，抑制腸球菌的生長。據(jù)文獻報道[7]，優(yōu)桿菌是人和動物口腔與腸道正常菌群的成員，對機體有營養(yǎng)生物拮抗和維持腸道微生物生態(tài)學平衡等功能。而腸球菌是引起感染的重要病原菌[8]，對多種抗生素具有耐藥性。故大蒜素對腸道菌群結(jié)構(gòu)具有很好的保護作用。

3.2研究意義 肝臟是人體最大的器官，具有雙重血液供應系統(tǒng)，與腸道之間存在密切的聯(lián)系，形成腸—肝軸。在肝損傷的發(fā)生發(fā)展中，腸道菌群發(fā)揮著重要作用，腸道與肝損傷之間相互促進相互影響的關(guān)系也被逐漸闡明[9]。人體腸道細菌以厭氧菌為主，傳統(tǒng)的微生物技術(shù)如培養(yǎng)計數(shù)技術(shù)，僅能反映腸道菌群數(shù)目變化這一指標，更有超過70%的腸道菌群無法通過傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)和鑒定，不能反映腸道菌群結(jié)構(gòu)的多樣性和種群變化，因此，ERIC-PCR、PCR-DGGE等分子生物學方法被廣泛用于菌群結(jié)構(gòu)及種群變化，具有靈敏度高、可重復性、可靠性好，省時省力等優(yōu)點。本研究利用ERIC-PCR和PCR-DGGE技術(shù)分析大蒜素對酒精性肝損傷小鼠腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)急性酒精性肝損傷小鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，大蒜素預防給藥能夠增加小鼠腸道中益生菌數(shù)量，抑制致病菌生長，為大蒜素預防酒精性肝損傷伴有腸道菌群失調(diào)提供實驗依據(jù)，為深入研究腸道菌群在酒精性肝損傷發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎，以腸道菌群作為篩選治療酒精性肝病藥物的新靶點。

3.3同類研究的比較 天然產(chǎn)物具有益生元樣作用，且藥物資源豐富、療效獨特、毒副作用小，具有“已病治病，未病防病，無病強身”的特點。例如茵陳合劑可以調(diào)節(jié)肝細胞生長因子，促進肝細胞的再生，改善肝功能，恢復腸道微生態(tài)平衡[10]；藏方甲嘎松湯能夠降低急性肝損傷小鼠肝臟IL-6、IFN-γ、TGF-β1水平，增加腸道中雙歧桿菌數(shù)量，對急性肝損傷小鼠具有保肝作用[11]?？傊?，天然產(chǎn)品在防治急性酒精性肝損傷及其伴有的腸道菌群失調(diào)方面體現(xiàn)出許多優(yōu)勢，其開發(fā)潛能引起人們的關(guān)注。

3.4研究的不足 大蒜素對急性酒精性肝損傷伴有的腸道菌群失調(diào)具有一定的預防作用，主要表現(xiàn)為促進優(yōu)桿菌屬的生長，同時對腸球菌等病原菌有抑制作用，為研究肝損傷和腸道菌群的關(guān)系和藥物篩選提供新的思路與途徑。ERIC-PCR和PCR-DGGE為半定量分析，在后續(xù)實驗中增加Real-time PCR對小鼠腸道中的優(yōu)勢菌群進行定量分析，并且希望通過對小鼠腸道機械屏障、免疫屏障等的研究闡明大蒜素對腸道菌群的作用機制。

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