黃毅溦，金鑫，娜迪拉·巴吾爾江，葛亞中，蔡美琴

1.上海交通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，上海 200025； 2.無(wú)限極(中國(guó))有限公司，廣東 廣州 510665

便秘(chronic constipation，CC)是一種臨床常見(jiàn)的功能性胃腸病，已成為困擾現(xiàn)代人的主要健康問(wèn)題之一，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量[1]。研究表明，便秘患者普遍存在腸道蠕動(dòng)緩慢，腸道菌群紊亂[2]等現(xiàn)象。使用益生菌制劑能夠改善腸道菌群紊亂，提高腸道菌群定植抗力，增強(qiáng)小腸蠕動(dòng)能力，改善便秘癥狀?，F(xiàn)有研究表明，部分單菌種益生菌對(duì)于便秘癥狀有改善作用[3-5]，而多菌種合用對(duì)便秘癥狀的改善作用研究則相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)意在研究新型嗜酸乳桿菌NCFM-乳雙歧桿菌Bi-07-鼠李糖乳桿菌NH001三聯(lián)益生菌制劑對(duì)小鼠腸道菌群構(gòu)成比例的調(diào)節(jié)作用，以及其對(duì)便秘小鼠小腸蠕動(dòng)作用的促進(jìn)從而改善功能性便秘的能力。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)用益生菌及劑量配置 新型三聯(lián)益生菌制劑(主要成分為菊粉、嗜酸乳桿菌NCFM、乳雙歧桿菌Bi-07、山楂粉、山藥粉、鼠李糖乳桿菌HN001)由無(wú)限極(中國(guó))有限公司提供。規(guī)格：2 g/包，活菌總數(shù)不低于1.0×1010CFU/g。以人體推薦量的10倍為其中的一個(gè)劑量組即中劑量組，另設(shè)5倍低劑量組及30倍高劑量組。該新型三聯(lián)益生菌的人體推薦量為2 g/d，按照標(biāo)準(zhǔn)人體重量60 kg計(jì)算，人體正常劑量為0.033 g/(kg·bw)，則：低劑量組=0.165 g/(kg·bw)、中劑量組=0.330 g/(kg·bw)、高劑量組=0.990 g/(kg·bw)。益生菌制劑的配置：低劑量組，準(zhǔn)確稱取受試益生菌制劑0.0825 g，蒸餾水定容至10 mL并混勻；中劑量組，準(zhǔn)確稱取受試益生菌制劑0.165 g，蒸餾水定容至10 mL并混勻；高劑量組準(zhǔn)確稱取受試益生菌制劑0.495 g，蒸餾水定容至10 mL并混勻。

1.2小腸推進(jìn)率實(shí)驗(yàn)

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性昆明小鼠共50只，SPF級(jí)，體重18～22 g，購(gòu)于上海斯萊克生物科技有公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002]，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)部屏障環(huán)境內(nèi)。

1.2.2藥物及試劑 復(fù)方地芬諾酯片(每片含復(fù)方地芬諾酯2.5 mg，江蘇華陽(yáng)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H32020933)；阿拉伯樹(shù)膠(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；活性碳粉；小鼠飼料[上海普路騰生物科技有限公司斯萊康大小鼠繁殖飼料，生產(chǎn)許可證：滬飼證(2014)04001]。墨汁的配置：準(zhǔn)確稱取阿拉伯樹(shù)膠10 g，加水80 mL，煮沸至溶液透明，稱取活性炭(粉狀)5 g加至上述溶液中煮沸3次，待溶液涼后加水定容到100 mL，于冰箱中4℃保存，用前搖勻。0.5%復(fù)方地芬諾酯混懸液的配制：復(fù)方地芬諾酯片，每片含復(fù)方地芬諾酯2.5 mg，取復(fù)方地芬諾酯50 mg(20片)，用研缽研碎成粉末后加水至10 mL，臨用前配制。

1.2.3實(shí)驗(yàn)方法 參照中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003版)中保健食品對(duì)因便秘引起腸道蠕動(dòng)抑制改善作用的檢測(cè)方法，所有小鼠進(jìn)行5 d適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察無(wú)異常后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組各10只。

每天早上9點(diǎn)固定時(shí)間對(duì)各組小鼠進(jìn)行灌胃。3個(gè)劑量組按照劑量設(shè)計(jì)方法，以0.2 mL/(10 g·bw)連續(xù)灌胃14 d，空白對(duì)照組與模型對(duì)照組以相同灌胃量連續(xù)給予蒸餾水14 d。每天早上均準(zhǔn)確稱取每只小鼠體重，及時(shí)調(diào)整灌胃量。第14天末次灌胃后，各組小鼠禁食不禁水24 h。除空白對(duì)照組以外，各組小鼠以50 mg/(kg·bw)口服復(fù)方地芬諾酯混懸液[即0.1 mL/(10 g·bw)]，空白對(duì)照組以相同灌胃量給予蒸餾水。45 min后以0.5 mL/只給予各組小鼠墨汁灌胃，30 min后立即脫頸椎處死各組小鼠，開(kāi)腹取小腸，剪取上端自幽門、下端至回盲部的腸管，輕拉成直線，測(cè)量小腸總長(zhǎng)度及墨汁推進(jìn)最前端長(zhǎng)度，計(jì)算每只小鼠小腸墨汁推進(jìn)率。小腸墨汁推進(jìn)率=墨汁推進(jìn)長(zhǎng)度/小腸總長(zhǎng)度×100%。

1.3腸道菌群調(diào)節(jié)作用實(shí)驗(yàn)

1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性BALB/c小鼠共42只，SPF級(jí)，體重18～22 g，購(gòu)于上海靈暢生物科技有限公司[生產(chǎn)許可證：SCXK(滬)2013-0018]，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)部屏障環(huán)境內(nèi)。

1.3.2藥物及試劑 小鼠飼料[上海普路騰生物科技有限公司斯萊康大小鼠繁殖飼料，生產(chǎn)許可證：滬飼證(2014)04001]；小鼠糞便DNA提取盒QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit(51604)(美國(guó)QIAamp公司)。

1.3.3實(shí)驗(yàn)方法 參照中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003版)中保健食品對(duì)腸道菌群調(diào)節(jié)作用的檢測(cè)方法，所有小鼠進(jìn)行5 d適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察無(wú)異常后隨機(jī)抽取10只小鼠，在無(wú)菌環(huán)境下對(duì)糞便進(jìn)行取樣作為自身前后對(duì)比的空白組(A組)，隨后將所有小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(B組)、低劑量組(C組)、中劑量組(D組)、高劑量組(E組)。

每天早上9點(diǎn)固定時(shí)間對(duì)各組小鼠進(jìn)行灌胃。3個(gè)劑量組按照劑量設(shè)計(jì)方法，以0.2 mL/(10 g·bw)連續(xù)灌胃30 d，空白對(duì)照組以相同灌胃量連續(xù)給予蒸餾水30 d。每天早上準(zhǔn)確稱取每只小鼠體重，及時(shí)調(diào)整灌胃量。第30天末次灌胃后，無(wú)菌環(huán)境下對(duì)所有小鼠糞便進(jìn)行取樣封裝，并于-80℃冰箱保存至進(jìn)行DNA提取與分析。小鼠糞便DNA提取及16S rDNA測(cè)序分析由上海銳翌生物科技有限公司完成。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 小腸推進(jìn)率實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，其中各組間多重比較采用Dunnet′t檢驗(yàn)。腸道菌群調(diào)節(jié)作用實(shí)驗(yàn)中各組腸道菌群差異使用非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1新型三聯(lián)益生菌短期及長(zhǎng)期使用對(duì)小鼠體重的影響 由表1、2可知，兩實(shí)驗(yàn)從開(kāi)始到結(jié)束的過(guò)程中，各組小鼠的體重逐步增加，體重變化在各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明小鼠體重增長(zhǎng)均來(lái)自進(jìn)食及自身正常生長(zhǎng)。并且，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組小鼠均保持正常進(jìn)食進(jìn)水，毛色正常，精神狀態(tài)良好。表明該新型三聯(lián)益生菌不同劑量的短期及長(zhǎng)期使用對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)無(wú)作用，同時(shí)對(duì)小鼠生長(zhǎng)無(wú)不良反應(yīng)。

表1 新型三聯(lián)益生菌對(duì)小腸推進(jìn)率實(shí)驗(yàn)各組小鼠體重的影響

2.2新型三聯(lián)益生菌對(duì)便秘小鼠小腸墨汁推進(jìn)率的影響 由表3可知，便秘模型對(duì)照組小鼠小腸推進(jìn)率顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，表明小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)中便秘模型建立成功。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，低、中、高劑量組小鼠的墨汁推進(jìn)率數(shù)值均高于模型對(duì)照組，其中高劑量組小鼠小腸墨汁推進(jìn)率顯著高于模型對(duì)照組(P<0.05)，表明新型嗜酸乳桿菌NCFM-乳雙歧桿菌Bi-07-鼠李糖乳桿菌NH001三聯(lián)益生菌對(duì)便秘小鼠小腸蠕動(dòng)有促進(jìn)作用。

2.3新型三聯(lián)益生菌對(duì)小鼠腸道菌群的影響

2.3.1新型三聯(lián)益生菌對(duì)小鼠腸道菌群多樣性的影響 由表4、圖1可知，各組間腸道菌群多樣性不盡相同。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均用來(lái)估算微生物群落的多樣性，兩者值越大，說(shuō)明被測(cè)樣品的菌群多樣性越高。比較各組小鼠糞便中菌群多樣性指數(shù)Simpson 值及Shannon 值后發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d的小鼠腸道菌群多樣性顯著低于其他各組，正常進(jìn)食進(jìn)水給予蒸餾水灌胃飼養(yǎng)30 d對(duì)于小鼠腸道菌群多樣性有改善，同時(shí)相同飼養(yǎng)條件給予不同劑量新型三聯(lián)益生菌灌胃相較單給予蒸餾水對(duì)于小鼠腸道菌群多樣性有更顯著改善。

表3 新型三聯(lián)益生菌制劑對(duì)便秘小鼠小腸墨汁推進(jìn)率的影響

注：a、b、c與模型對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。

PCoA分析能夠展示各組間的差異大小，如果各組間距離較近，則表示各組的腸道菌群組成較相近；反之，各組間距離較遠(yuǎn)，則表示各組的腸道菌群組成有差異。由圖2可看出，自身空白對(duì)照組(A組)和空白對(duì)照組(B組)兩組小鼠腸道菌群組成均數(shù)接近，但B組小鼠腸道菌群組成較A組更多樣；低中高劑量組(CDE組)各劑量組之間小鼠腸道菌群組成接近，但與AB兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明給予新型三聯(lián)益生菌30 d后對(duì)于小鼠腸道菌群組成有顯著改變。

表4 新型三聯(lián)益生菌對(duì)小鼠腸道菌群多樣性的影響

A：自身對(duì)照空白組，B：空白對(duì)照組，C：低劑量組，D：中劑量組，E：高劑量組

A：自身對(duì)照空白組，B：空白對(duì)照組，C：低劑量組，D：中劑量組，E：高劑量組

圖2各組小鼠糞便中菌群多樣性的PCoA分析

2.3.2新型三聯(lián)益生菌對(duì)小鼠腸道菌群豐度的影響 由圖3、圖4豐度圖可以解讀所有小鼠及各劑量組組間優(yōu)勢(shì)菌種的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擬桿菌科各劑量組前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，三聯(lián)益生菌制劑組和蒸餾水組顯著減少，并且各劑量組減少程度均比空白對(duì)照組更大。A組中明顯無(wú)乳桿菌，而劑量組中乳桿菌顯著增加。

2.3.3新型三聯(lián)益生菌對(duì)小鼠腸道特殊菌群的影響 由表5可知，各組小鼠糞便中雙歧桿菌、腸球菌、乳桿菌、腸桿菌、梭菌菌量均數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異：各劑量組小鼠糞便中雙歧桿菌和乳桿菌在屬和科水平較未給予三聯(lián)益生菌制劑前有顯著性提高，且乳桿菌各劑量組增長(zhǎng)程度較蒸餾水組更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各劑量組小鼠糞便中梭菌、腸球菌在屬水平較未給予益生菌制劑前有顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各劑量組小鼠糞便中腸桿菌在屬水平較未給予益生菌制劑前有顯著性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

K1-10為A組樣品、K1d-10d為B組樣品、J5b1-10為C組樣品、J10b1-11為D組樣品、J30b1-11為E組樣品

A：自身對(duì)照空白組，B：空白對(duì)照組，C：低劑量組，D：中劑量組，E：高劑量組

圖4各組小鼠糞便中菌群屬水平豐度圖

3 討 論

3.1腸道菌群與便秘 目前研究發(fā)現(xiàn)慢性便秘不僅與飲食結(jié)構(gòu)、腸道動(dòng)力學(xué)有關(guān)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)便秘患者腸道菌群結(jié)構(gòu)與健康人群存在較大差異，腸道菌群紊亂可能參與便秘發(fā)病[6-7]。

Wang、Kang等[8-9]對(duì)便秘患者及健康人群糞便進(jìn)行菌群培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，便秘患者糞便中雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量顯著低于健康人群，而大腸埃希菌等條件致病菌及真菌則顯著高于健康人群。隨著16S rDNA技術(shù)的發(fā)展，可以通過(guò)DNA測(cè)序手段更準(zhǔn)確的測(cè)定并分析腸道菌群種類及其結(jié)構(gòu)組成，為腸道菌群在慢性便秘中的作用提供更全面的信息及證據(jù)[10-11]。安瑩瑩[12]對(duì)便秘患者及健康人群糞便進(jìn)行16S rDNA測(cè)序分析后發(fā)現(xiàn)便秘患者腸道菌群豐度及多樣性顯著低于健康人群，慢性便秘組擬桿菌門(Bacteroidetes)、腸球菌門(Enterococcus)所占比例顯著高于健康正常人組，而乳桿菌屬(Lactobacillus)顯著減少。隨后通過(guò)提取便秘患者糞便菌群制作菌群液，對(duì)小鼠進(jìn)行連續(xù)灌胃15 d后發(fā)現(xiàn)灌胃組小鼠排便頻率、排便量及小腸墨汁推進(jìn)率顯著低于對(duì)照組。李根林等[13]發(fā)現(xiàn)便秘初期小鼠雙歧桿菌與乳桿菌顯著減少，后期大腸埃希菌、雙歧桿菌增多，乳桿菌持續(xù)減少。說(shuō)明便秘患者腸道菌群紊亂與其便秘發(fā)病及癥狀相關(guān)。

3.2結(jié)果分析 多項(xiàng)RCT研究表明，對(duì)便秘患者使用益生菌制劑后排便頻率顯著增多、結(jié)腸傳輸時(shí)間顯著加快[14-18]，并且對(duì)連續(xù)使用益生菌制劑的便秘患者腸道菌群進(jìn)行前后自身對(duì)照后發(fā)現(xiàn)其腸道菌群紊亂改善，菌群結(jié)構(gòu)組成向健康人群靠攏，便秘癥狀顯著緩解[19]。Dimidi等[20]對(duì)14項(xiàng)使用益生菌制劑治療便秘的RCT研究進(jìn)行Meta分析后發(fā)現(xiàn)，對(duì)比安慰劑組或自身前后對(duì)比，便秘患者使用益生菌制劑后糞便在腸道中運(yùn)輸時(shí)間顯著下降，排便頻率顯著上升，該效果在使用含雙歧桿菌的益生菌產(chǎn)品中更加顯著?，F(xiàn)有研究中發(fā)現(xiàn)單菌株益生菌具有改善便秘的作用[3-5]，但是對(duì)于多菌株聯(lián)合使用對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)以及其對(duì)便秘的改善作用尚較少。本研究中，使用大劑量復(fù)方地芬諾酯制造便秘模型并對(duì)便秘小鼠使用新型三聯(lián)益生菌制劑后發(fā)現(xiàn)，高劑量組小腸推進(jìn)率顯著加快，而低、中劑量組小腸推進(jìn)率也有明顯加快趨勢(shì)，說(shuō)明該新型三聯(lián)益生菌制劑能夠有效增快便秘小鼠小腸推進(jìn)率。

表5 新型三聯(lián)益生菌小鼠糞便中不同微生物級(jí)別菌群的影響

注：A：自身對(duì)照空白組，B：空白對(duì)照組，C：低劑量組，D：中劑量組，E：高劑量組。

同時(shí)，對(duì)使用不同劑量灌胃的正常小鼠腸道菌群進(jìn)行16S rDNA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)使用益生菌制劑后其腸道菌群多樣性顯著增加，雙歧桿菌屬、乳桿菌屬等腸道優(yōu)勢(shì)菌顯著增加，大腸埃希菌屬、梭菌屬、腸球菌屬等條件致病菌顯著減少，提示新型三聯(lián)益生菌能夠改善小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，推測(cè)其可能為改善便秘的原因。

3.3益生菌改善便秘的可能機(jī)制 腸道菌群按照生理作用可分為三類：即生理性菌群，主要包括雙歧桿菌、乳桿菌等專性厭氧菌，為腸道優(yōu)勢(shì)菌群，對(duì)腸道正常生理功能起保護(hù)作用；條件致病菌，包括大腸埃希菌、腸球菌、梭菌等，多為專性厭氧菌，僅在滿足特定條件下對(duì)宿主產(chǎn)生影響；病原菌，多為變形桿菌等，如在腸道長(zhǎng)期定植并大量繁殖可導(dǎo)致人體發(fā)病[21-22]。腸道菌群促進(jìn)腸蠕動(dòng)的機(jī)制尚不明確，可能與雙歧桿菌、乳桿菌等專性厭氧菌在腸道內(nèi)發(fā)酵、降解，降低腸道pH及其代謝產(chǎn)物中的短鏈脂肪酸(SCFAs)有關(guān)。SCFAs能夠刺激回腸的推進(jìn)與收縮，通過(guò)與腸道細(xì)胞表面受體作用，對(duì)腸壁神經(jīng)有良好的刺激作用，能夠促進(jìn)腸道分泌5-羥色胺(5-HT)[23]。5-HT能夠通過(guò)提高腸道通透性，增加腸內(nèi)滲透壓、增加水分分泌，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，是參與調(diào)節(jié)腸道蠕動(dòng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)[24-25]。同時(shí)SCFAs能夠降低腸道pH，促進(jìn)結(jié)腸蠕動(dòng)，研究證明給予SCFAs能夠有效減少糞便在結(jié)腸中傳輸時(shí)間[23,26]。低pH環(huán)境同樣能夠以正反饋調(diào)節(jié)促進(jìn)專性厭氧菌在腸道的定植，使SCFAs競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合腸上皮細(xì)胞或黏膜上受體結(jié)合位，從而提高定植抗力，抑制條件致病菌及病原菌的定植和繁殖，改善便秘患者腸道菌群紊亂、維持正常腸道菌群結(jié)構(gòu)[9,27]，幫助預(yù)防及緩解因腸道菌群紊亂引起的便秘及其癥狀。

3.4本研究的不足之處 本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)新型嗜酸乳桿菌NCFM-乳雙歧桿菌Bi-07-鼠李糖乳桿菌NH001三聯(lián)益生菌制劑對(duì)正常小鼠腸道菌群有正向調(diào)節(jié)作用，但是對(duì)便秘模型小鼠腸道菌群作用如何有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，研究雖然提示該益生菌對(duì)便秘小鼠有促進(jìn)腸道蠕動(dòng)作用，但是本研究只是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)人體便秘是否有效以及緩解便秘的具體機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.5結(jié)論 本研究提示，新型嗜酸乳桿菌NCFM-乳雙歧桿菌Bi-07-鼠李糖乳桿菌NH001三聯(lián)益生菌制劑能夠改善小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，同時(shí)能夠促進(jìn)便秘小鼠腸道蠕動(dòng)，幫助便秘癥狀緩解。

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