李凱旋，趙小軍，魏娟，王建云，潘奇

西安醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院 檢驗科，陜西 西安 710038

鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii，A.baumannii)是我國院內感染最常見的病原菌之一，是一類氧化酶陰性、非發(fā)酵糖的革蘭陰性桿菌，調查顯示全球不同國家多重耐藥、廣泛耐藥、全耐藥的鮑曼不動桿菌都呈流行趨勢[1]。對臨床常用抗菌素的耐藥率達84.96%[2]，感染率最高的是重癥監(jiān)護病房(ICU)患者，病死率也逐年增高，達10%～43%[3]，引起國內外醫(yī)療機構極高的關注。因此，探索尋找新的抗菌藥物或藥物增效劑迫在眉睫。傳統(tǒng)中藥在治療感染性疾病方面有著悠久的歷史，相關研究顯示中藥制劑對多重耐藥細菌有明顯的抑菌作用[4]。本研究采用藥敏紙片瓊脂擴散法和微量肉湯稀釋法對板藍根、魚腥草、黃芩、黃連、五倍子、金銀花、苦參、連翹、烏梅和穿心蓮等10種單味中藥免煎顆粒劑的體外抑菌作用進行檢測。

1 材料與方法

1.1菌株的選取 收集來自本院2016年1月到12月門診及住院患者的各種臨床標本30株，包括痰液23株，傷口分泌物3株，血培養(yǎng)3株，尿液1株。選擇標準菌株大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌 ATCC 27853(均購于上海三踏生物科技有限公司)用于對比分析。

1.2中藥顆粒劑 板藍根、魚腥草、黃芩、黃連、五倍子、金銀花、苦參、連翹、烏梅和穿心蓮均由廣東一方藥業(yè)公司提供，工藝先進，質量可靠。

1.3儀器和耗材 全自動細菌鑒定儀VITEK-2(法國生物梅里埃公司)，恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司)，細菌比濁儀(山東鑫科生物科技股份有限公司)，精密分析天平(Mettler-Toledo儀器上海有限公司)，瓊脂粉(杭州濱和微生物試劑有限公司)，LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(杭州濱和微生物試劑有限公司)，96孔細胞培養(yǎng)板(賽業(yè)生物科技有限公司)。

1.4方法

1.4.1細菌分離及鑒定 對臨床分離的各種標本進行接種、培養(yǎng)，參照《臨床微生物學操作規(guī)程》，用法國生物梅里埃全自動細菌鑒定儀進行細菌鑒定，采用藥敏紙片瓊脂擴散法和微量肉湯稀釋法相結合進行藥敏分析，參照美國CLSI標準(2012版)規(guī)定進行結果判定，篩選出符合實驗要求的多重耐藥鮑曼不動桿菌。

1.4.2中藥顆粒劑的制備 取適量中藥免煎顆粒劑用精密分析天平精確稱量，倒入燒杯中用無菌蒸餾水溶解，得每毫升相當于1 g中藥材的中藥免煎顆粒溶液，用濾紙過濾去除藥渣顆粒，分裝于試管中121℃高壓滅菌15～20 min，收集濾液靜置備用。

1.4.3液體培養(yǎng)基的配制 稱取5.5 g營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基于錐形瓶中，加入250 mL蒸餾水，震蕩搖勻使培養(yǎng)基完全溶解，必要時加熱煮沸，用橡膠塞封口，121℃高壓滅菌15～20 min，超凈臺放涼備用。

1.4.4菌懸液的制備 將凍存的已經(jīng)過臨床分離鑒定的多重耐藥A.baumannii接種于血平板中，35℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，挑取分離純化的菌落于無菌生理鹽水中，校正濃度至0.5麥氏濁度。

1.4.5藥敏紙片瓊脂擴散法 用打孔器將新華1號定性濾紙制成直徑為5 mm的小紙片，放入平皿中，121℃高壓滅菌15～20 min，取出放涼即為無菌紙片。MH瓊脂平板均勻涂上0.5麥氏單位的菌懸液，選取亞胺培南藥敏紙片作陽性對照貼于中間，6片無菌小紙片貼于四周，用滅菌的加樣槍加入10 μL的中藥顆粒劑溶液，每種顆粒劑重復3次，35℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h后測量抑菌圈的大小，所有結果取平均值計算。

1.4.6最低抑菌濃度(MIC)測定 96孔細胞培養(yǎng)板高壓滅菌，將第一排和第二排標記為“肉湯空白對照、肉湯加菌陽性對照”。第三排第一孔加入相當于1 g/mL的中藥濾清液200 μL，依次每孔加入100 μL肉湯對中藥濾清液進行倍比稀釋，第三排只加藥液作為藥液對照組。第四排第一孔加入相當于1 g/mL的中藥濾清液100 μL，依次每孔加入100 μL菌懸液，從第二孔開始加入1 g/mL的中藥濾清液100 μL倍比稀釋，這樣每孔的藥物濃度與第三排每孔的藥物濃度相同形成對照。按上述方法，依次加入10種中藥濾清液，將細胞培養(yǎng)板置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察有無細菌生長。

1.5統(tǒng)計學處理 用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，10種中藥免煎顆粒對多重耐藥A.baumannii的MIC值比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1藥敏紙片瓊脂擴散法 10種中藥免煎顆粒劑對隨機選取的10株多重耐藥A.baumannii抑菌效果各不同，五倍子抑菌作用最強，黃芩次之；五倍子抑菌圈直徑為17～30 mm，黃芩抑菌圈直徑為9～22 mm；黃連、魚腥草抑菌活性相對較弱，而烏梅、連翹、板藍根、苦參、金銀花和穿心蓮的抑菌作用很弱甚至無抑菌作用(表1)。

表1 中藥五倍子、黃芩對臨床多重耐藥A. baumannii的抗菌作用

2.2微量肉湯稀釋法 結果顯示五倍子對多重耐藥A.baumannii抑菌作用最強，MIC值為0.975 mg/mL；黃芩次之，MIC值為15.63 mg/mL；烏梅抑菌作用相對較弱，MIC值為62.5 mg/mL；而黃連、魚腥草、連翹、板藍根、苦參、金銀花和穿心蓮的抑菌作用很弱甚至無抑菌作用(t=1.639，P>0.05)(表2)。

表2 10種中藥免煎顆粒對MDR-AB的體外抑菌活性

注：“-”有抑菌活性，“+”無抑菌活性(肉眼觀察)。

3 討 論

3.1鮑曼不動桿菌耐藥現(xiàn)狀 據(jù)權威部門統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，抗菌素在我國醫(yī)療行為中的使用率高達70%，遠高于歐美等發(fā)達國家，但真正需要抗菌素治療的疾病不到20%[5]。濫用抗菌素成為我國多重耐藥細菌逐年增多的重要原因。A.baumannii是一種條件致病菌，最常見于住院患者尤其是燒傷患者或ICU患者，主要由長期應用抗菌藥物、留置管道、各種侵入性操作、基礎疾病長期臥床、機體免疫力低下等因素導致感染[6]。A.baumannii僅對多粘菌素B的敏感性最高，耐藥率為1.4%，但因其腎毒和神經(jīng)毒性作用，臨床甚少使用；對頭孢哌酮-舒巴坦、米諾環(huán)素、左氧氟沙星和阿米卡星的耐藥率分別為33.0%、42.2%、45.5%和40.2%，對頭孢吡肟、頭孢西丁、頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南和環(huán)丙沙星等耐藥率均在50%以上，且有逐年增高的趨勢[7-9,11]。因此探索新型抗菌藥物或藥物替代劑已成為國內外相關學者關注的焦點。

3.2中藥抑菌研究分析 中國傳統(tǒng)中藥抑菌譜廣，毒副作用小，在菌體內作用途徑多樣化，能產生多方面藥理效應，且具有避免細菌耐藥和抑制細菌生長的功效，與抗菌藥物聯(lián)合使用更能增強抗菌藥物殺菌和抗感染能力，成為抗感染藥物的另一研究重點。有研究表明中藥可阻斷細菌某些組分的合成或抑制細菌外排泵，從而達到抑菌作用[9]。本研究通過對板藍根、魚腥草、黃芩、黃連、五倍子、金銀花、苦參、連翹、烏梅和穿心蓮等10味中藥免煎顆粒劑進行體外抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)五倍子對A.baumannii抑菌作用最強，抑菌圈直徑為17～30 mm，MIC值為0.975 mg/mL；與陳澤慧[10]報道的五味子、石榴皮等中草藥對A.baumannii有一定的抑菌作用結果一致。黃芩也有較好的抑菌效果，抑菌圈直徑為9～22 mm，MIC值為15.63 mg/mL；烏梅抑菌活性相對較弱，MIC值為62.5 mg/mL；而黃連、魚腥草、連翹、板藍根、苦參、金銀花和穿心蓮的抑菌活性很弱甚至無抑菌效果。五倍子對革蘭陰性菌和陽性菌均有很好的抑菌作用，這與五倍子含有大量鞣質，可與細菌蛋白質結合形成鞣質蛋白，從而起到抑制或殺滅細菌的作用有關[2,9]。

3.3本研究不足及后期方向 本研究為臨床治療多重耐藥鮑曼不動桿菌感染提供新的治療思路，但發(fā)揮抑菌作用的具體中藥抑菌成分仍不太清楚，目前國內外中藥抑菌研究都處于體外實驗階段，抗菌中藥的體內實驗、臨床試驗仍然較少[12]。因此，選擇合適的實驗方法，加強對中藥抑菌活性成分和機制的研究，使其更具有科學性、理論性；為今后體外實驗、動物實驗、臨床試驗及應用提供理論依據(jù)，確保藥物的安全性和有效性，使中藥的抑菌活性真正發(fā)揮其功效。期望具有抑菌活性的中藥能在多重耐藥A.baumannii感染中發(fā)揮作用。

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