劉建斌，王誠誠，樊慧英，李 海，楊初平，曾應(yīng)新，徐初東，陳榮聲，2

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.電子工程學(xué)院；b.獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2. Nuffield Department of Clinical Neurosciences, University of Oxford, Oxford OX3 9DU, UK)

一般情況下，細(xì)胞培養(yǎng)是把傳代好的細(xì)胞放入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，然后把培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿放入設(shè)置好溫度和二氧化碳體積分?jǐn)?shù)的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng). 由于細(xì)胞在代謝過程中需要消耗氧氣，有氧氣交換過程，因此培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的蓋子不能擰緊. 在培養(yǎng)液中氧的體積分?jǐn)?shù)和空氣中的氧的體積分?jǐn)?shù)處于平衡狀態(tài)下，細(xì)胞的生存、繁殖、變異會受培養(yǎng)液中的氧分壓的影響[1-6]. 在平衡態(tài)下，氣相中氧氣的體積分?jǐn)?shù)21%對應(yīng)液相中氧分壓21kPa. 然而，在實際的細(xì)胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)液中的氧分壓盡管接近21kPa，但是也要受到2個因素的影響：其一是媒質(zhì)給細(xì)胞的供氧能力；其二是細(xì)胞的耗氧能力. 通常情況下，在培養(yǎng)細(xì)胞時，不會考慮培養(yǎng)液中的氧分壓，因為，在培養(yǎng)過程中會給細(xì)胞提供足夠的氧. 但是，在某些情況下，比如活體干細(xì)胞的培養(yǎng)和移植過程中，干細(xì)胞的生長對氧分壓非常敏感，2008年SimonandKeith以及Lin等研究表明，干細(xì)胞適于在低氧分壓環(huán)境下生存. 在低氧環(huán)境下，通過改變氧分壓的值，可以修改干細(xì)胞的外型[7-8]. 因此，一些研究者認(rèn)為，細(xì)胞周圍的氧分壓是能夠反映細(xì)胞的功能狀態(tài)(包括細(xì)胞分化、生長、線粒體的能量代謝)的重要因素之一[3]. 因此，對細(xì)胞培養(yǎng)過程中的氧分壓進(jìn)行監(jiān)測具有重要的意義.

活體外的氧分壓監(jiān)測的標(biāo)準(zhǔn)方法為Clarke-type電極法[5-6]：電極法的傳感器由電解液以及處于其中的陰極和陽極組成,電解液由外層能夠滲透氧氣的膜包圍. 當(dāng)氧氣通過薄膜和電解液擴(kuò)散到達(dá)陰極時,陰極附近的氫氧根離子會減少. 陰極提供電子給氧分子，同時在陰極和陽極間的電流與樣品的氧分壓成正比. 由于電極本身消耗氧氣，因此電極法測得的氧分壓值將低于實際值. 在Pettersen等的研究中[9],用微電極監(jiān)測靜態(tài)條件下的細(xì)胞培養(yǎng)的氧分壓,測量發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周圍的氧含量和環(huán)境空氣中的氧含量有顯著差別. 另一方法是使用氧敏感的熒光體溶解在介質(zhì)中測量氧分壓[1],但是敏感的熒光團(tuán)可能對細(xì)胞有毒性. 以上傳感方法存在缺點(如費(fèi)用高、有限的使用壽命、響應(yīng)時間長等)，不適合持續(xù)監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)過程中的氧分壓變化. 因為電化學(xué)傳感器本身消耗氧氣，再者溶氧敏感熒光團(tuán)的組織培養(yǎng)需要遠(yuǎn)離培養(yǎng)箱才能讀取有用的信息. 為了克服這些缺點，基于熒光淬滅的氧傳感器為測量活體外氧分壓提供了另一種選擇[10-12]. 有研究報道，把柔性的傳感器放到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中監(jiān)測氧分壓值[13]，但是大體積的光學(xué)系統(tǒng)很難放入傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)箱中.

本文介紹將光纖氧氣傳感器用于監(jiān)測培養(yǎng)液中細(xì)胞的氧分壓的實驗方法. 以含鉑金Pt(Ⅱ)的復(fù)合物，Platinum-Octaethyl-Porphyrin(PtOEP),作為氧傳感發(fā)光材料，以聚乙烯(甲基丙烯酸乙酯，PEMA)作為基體固定發(fā)光體. 把氧傳感發(fā)光材料涂覆在圓柱形光纖的拋光面上，光纖后端有光纖分接頭，可以與LED激發(fā)光源和計算機(jī)處理系統(tǒng)相連，這樣就組成了基于光纖氧傳感器的細(xì)胞培養(yǎng)氧分壓的監(jiān)測系統(tǒng). 該系統(tǒng)可以測量液相中的氧分壓變化，實驗結(jié)果表明：細(xì)胞密度越高,處于空氣環(huán)境的培養(yǎng)液中的氧分壓越低.

1 原理與方法

1.1 原理

光纖氧氣傳感器的基本原理是基于氧氣的熒光淬滅. 在動態(tài)的淬滅過程中，發(fā)光強(qiáng)度和發(fā)光壽命都與氧氣的體積分?jǐn)?shù)有關(guān)，而且滿足Stern-Volmer[14]關(guān)系：

1.2 光纖氧氣傳感器

1.2.1 高分子材料

為了獲得傳感器的最佳性能，預(yù)先研究了不同聚合物基體材料對傳感器的敏感度和響應(yīng)時間的影響[15]. 使用甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、甲基丙烯酸乙酯(PEMA)和甲基丙烯酸丙酯(PPMA)作為基體固定鉑金Pt(II)復(fù)合物. 實驗研究結(jié)果表明：以PEMA為基體的傳感器在敏感度和信噪比方面要優(yōu)于PMMA和PPMA. 此外，還測試了CO2分壓對PEMA傳感器的敏感度和響應(yīng)時間的影響. 實驗結(jié)果表明：把傳感器分別放在CO2分壓為0和5 kPa的水中，看不到CO2分壓對PEMA傳感器的敏感度和響應(yīng)時間有任何影響[8]. 因此，選定高分子材料PEMA作為基體固定發(fā)光體.

1.2.2 傳感器的制作

在傳感器制作中，PtOEP和PEMA分別作為發(fā)光體和基體材料，使用二氯甲烷作為溶劑溶解發(fā)光體和基體材料. 混合液的配制：1 mg PtOEP，100 mg PEMA，1 mL二氯甲烷. 把配比好的混合液放到1.5 mL的玻璃瓶中，用聚丙烯蓋子蓋好. 攪動玻璃瓶確保PEMA和PtOEP充分溶解在溶劑中. 去掉單模多模石英光纖的端截面處的氟化聚合物包覆層，然后用異丙醇清潔和裂解，接著浸漬在10 mL的PEMA和PtOEP的混合液中以形成傳感頭. 光纖的規(guī)格是：無水光纖(Low OH)，高數(shù)值孔徑0.43，長2.5 m，芯徑200 μm. 傳感頭放到空氣中干燥至少24 h.

1.2.3 傳感器的穩(wěn)定性

傳感器系統(tǒng)包括海洋光學(xué)公司提供的LED光源和接收系統(tǒng)，以及自制的傳感頭. 光纖傳感器產(chǎn)品的穩(wěn)定性測試是通過連續(xù)測量光傳感元件的發(fā)光壽命在室內(nèi)空氣環(huán)境中要超過100 h. 圖1所示為117 h熒光壽命的測量數(shù)據(jù)，結(jié)果表明該傳感器的性能穩(wěn)定,在117 h內(nèi)發(fā)光壽命的變化小于0.65 μs.

圖1 傳感器隨時間的穩(wěn)定性測試圖

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

實驗使用豬腎細(xì)胞(PK-15). 先把傳代好的細(xì)胞放到培養(yǎng)液中，再放入溫度為37 ℃、CO2的體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng). 當(dāng)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞長滿70%～80%時(一般2～3 d)，就要進(jìn)行細(xì)胞傳代. 當(dāng)細(xì)胞長滿90%～100%時即可進(jìn)行實驗.

準(zhǔn)備5個培養(yǎng)瓶，分別滴入0，1，2，3，4 mL的細(xì)胞培養(yǎng)液，然后，加入消化液使每個培養(yǎng)瓶的體積都是5 mL. 接著將5個細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱2 h,準(zhǔn)備進(jìn)行測試.

2 實驗與結(jié)果

2.1 傳感器定標(biāo)

使用發(fā)光相位檢測系統(tǒng)在液體測試瓶中進(jìn)行定標(biāo). 定標(biāo)過程中，水可以作為液體定標(biāo)的參考介質(zhì). 把光纖氧氣傳感端伸入37 ℃充滿O2和N2的混合氣體的液體測試瓶中. O2和N2的混合體積比例是0/100,2/98,5/95,15/85,21/79,40/60,分別對應(yīng)測試液體的氧分壓為0,2，5，15，21，40 kPa.

定標(biāo)曲線如圖2所示，圖2顯示了用光纖氧氣傳感器測試的37 ℃測試液中發(fā)光壽命隨氧分壓變化的情況.

圖2 37 ℃下熒光壽命隨氧分壓變化曲線及熒光壽命隨氧分壓變化響應(yīng)曲線

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)氧分壓測試

圖3是實驗裝置示意圖，LED光源是美國海洋公司(OCEAN OPTICS)生產(chǎn)的NeFox熒光探測器.

在細(xì)胞培養(yǎng)的實驗室進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)氧分壓測試實驗. 實驗中光纖氧氣傳感器的傳感頭放置在細(xì)胞培養(yǎng)瓶的固定位置，并且靠近培養(yǎng)瓶的底部. 5個不同細(xì)胞密度的培養(yǎng)瓶分別放置在有玻璃罩的環(huán)境溫度為37 ℃的實驗平臺上(該實驗平臺具有殺菌和消毒功能). 每個培養(yǎng)瓶中的氧分壓使用發(fā)光相位測量系統(tǒng)(NeroFox)進(jìn)行測量，測量數(shù)據(jù)記錄在電腦里. 在每個培養(yǎng)瓶的底部附近測量了幾個數(shù)據(jù)點，得到每組數(shù)據(jù)的測量平均值為氧分壓值.

圖3 實驗裝置示意圖

圖4顯示了不同時間的5個不同細(xì)胞密度的氧分壓數(shù)據(jù)記錄結(jié)果. 記錄過程中，先測量細(xì)胞密度比較小的培養(yǎng)瓶，再依次測量細(xì)胞密度大的培養(yǎng)瓶. 細(xì)胞密度的大小可以在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，通過傳代細(xì)胞實現(xiàn). 從圖4中可以看出，隨著細(xì)胞密度的增加，細(xì)胞消耗的氧增加，從而使氧分壓降低.

圖4 不同PK-15的細(xì)胞密度下氧分壓隨時間變化情況

2.3 細(xì)胞計數(shù)

測量5個細(xì)胞培養(yǎng)液樣品的氧分壓后，使用1 mL 0.25%胰蛋白酶消化這些細(xì)胞樣品約5 min，然后在5 mL細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)中重新懸浮培養(yǎng). 取大約20 μL的細(xì)胞懸液用于細(xì)胞計數(shù)系統(tǒng)進(jìn)行計數(shù). 計數(shù)系統(tǒng)的儀器型號是Counter Star System，該系統(tǒng)可以很好地估計出5個培養(yǎng)液中細(xì)胞的數(shù)量. 表1為使用光纖氧氣傳感器測量的氧分壓值和在每個細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的PK-15細(xì)胞密度.

表1 氧分壓值和在每個細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的PK-15細(xì)胞密度

3 結(jié) 論

以PK-15細(xì)胞為實驗樣品，對細(xì)胞周圍的氧分壓值進(jìn)行了測試. 實驗結(jié)果表明:隨著細(xì)胞密度的增高，測得的氧分壓的數(shù)據(jù)越小. 通過與細(xì)胞計數(shù)的結(jié)果進(jìn)行對比，也實驗證明了光纖氧氣傳感器能夠?qū)ε囵B(yǎng)液中細(xì)胞周圍的氧分壓進(jìn)行監(jiān)測,細(xì)胞培養(yǎng)中液相中的氧分壓水平不僅依賴于細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境氣相中的氧分壓，而且也依賴于細(xì)胞的密度和細(xì)胞代謝. 因此在細(xì)胞培養(yǎng)過程中需要監(jiān)視和控制氧分壓水平，以維持在一般生理條件下的細(xì)胞培養(yǎng)，并且使實驗條件具有可復(fù)制性和可比性.

參考文獻(xiàn)：

[1] Swartz H M. On tissue oxygen and hypoxia [J]. Antiviral Therapy, 2007,12(2):1111-1113.

[2] Demas J N, Degraff B A, Coleman P B. Oxygen sensors based on luminescence quenching [J]. Anal. Chem., 1999,71(23):793A-800A.

[3] Weiszenstein M, Pavlikova N, Elkalaf M, et al. The effect of pericellular oxygen levels on proteomic profile and lipogenesis in 3T3-L1 differentiated preadipocytes cultured on gas-permeable cultureware [J]. Plos One, 2016,11(3):e0152382.

[4] Clark L C Jr, Lyons C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery [J]. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1962,102(1):29-45.

[5] Hahn C E. Electrochemical analysis of clinical blood-gases gases and vapours [J]. Analyst, 1996,123(6):57R-86R.

[6] Oqino H, Asakura K. Development of a highly sensitive galvanic cell oxygen sensor [J]. Talata, 1995,42(2):305-310.

[7] Lin Q, Kim Y, Alarcon R M, et al. Oxygen and cell fate decisions [J]. Gene Regul. Syst. Biol., 2008,2(2):43-51.

[8] Simon M C, Keith B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function [J]. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2008,9(4):285-296.

[9] Pettersen E O, Larsen L H, Ramsing N B, et al. Pericellular oxygen depletion during ordinary tissue culturing, measured with oxygen microsensors [J]. Cell Proliferation, 2005,38(4):257-267.

[10] Chen R S, Farmery A D, Obeid A, et al. A cylindrical-core fibre-optic oxygen sensor based on fluorescence quenching of a platinum complex immobilized in a polymer matrix [J]. IEEE Sensors Journal, 2012,12(1):71-75.

[11] Sharma A, Wolfbeis O S. Unusually efficient quenching of the fluorescence of an energy transfer-based optical sensor for oxygen [J]. Anal. Chim. Acta, 1998,212(1/2):261-265．

[12] Choi M M F, Xiao D. Linear calibration function of luminescence quenching-based optical sensor for trace oxygen analysis [J]. Analyst, 1999,124(5):695-698．

[13] Chen R, Hahn C E, Farmery A D. A flowing liquid test system for assessing the linearity and time-response of rapid fibre optic oxygen partial pressure sensors [J]. Respiratory Physiology & Neurobiology, 2012,183(2):100-107.

[14] Kojima M, Takehara H, Akagi T, et al. Flexible sheet-type sensor for noninvasive measurement of cellular oxygen metabolism on a culture dish [J]. Plos One, 2015,10(12):e0143774.

[15] Chen R, Formenti F, McPeake H, et al. Experimental investigation of the effect of polymer matrices on polymer fibre optic oxygen sensors and their time response characteristics using a vacuum testing chamber and a liquid flow apparatus [J]. Sensors and Actuators B Chemical, 2016,222(169):531-535.