趙淑君，李鴻巖，阿米娜·哈山

(烏魯木齊市第一人民醫(yī)院病理科，新疆 烏魯木齊 830011)

先天性巨結腸(Hirschsprung′s disease，HD)是由于胚胎期神經嵴細胞干細胞在移行過程中發(fā)生中斷導致遠端腸管神經節(jié)細胞缺如而引起的一種先天性消化道畸形[1]，其臨床癥狀主要是胎便排出延遲、腹脹及腸梗阻等。目前，HD的主要治療方法是手術切除病變腸管，由于手術方法的不斷改進及微創(chuàng)化，適合手術的患者年齡也不斷提前，嬰幼兒手術越來越常見[2-3]。HD手術成功與否在于能否最大限度地保留正常腸管并完整切除病變腸管，這需要依賴術中快速冰凍蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色進行診斷，但由于在冰凍切片過程中易產生冰晶及裂隙，導致辨識神經節(jié)細胞及神經節(jié)細胞計數(shù)存在一定的困難，因此，需要建立一個快速、精準且易操作的術中快速病理診斷方法。本研究使用還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶(nicotinamide adenine dinuleotide phosphate diaphorase，NADPH-d)酶組織化學染色法用于HD術中快速病理診斷，并與術中快速冰凍HE染色法進行對比，以分析NADPH-d酶組織化學染色法在HD術中快速病理診斷中的價值，為建立快速、準確的HD術中快速診斷方法提供新的選擇。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2015年1月至2017 年3月新疆烏魯木齊兒童醫(yī)院收治的37例HD患兒的術中切除腸管作為觀察對象，所有病例術后經常規(guī)病理檢查確診為HD，其中男29例，女8例，年齡 3 d 至3個月，中位年齡為2個月；每例患兒的腸管分擴張段、痙攣段取材，置于低溫冰箱冷凍保存。另外取5例因壞死性小腸結腸炎行結腸造瘺術患兒的切除腸管標本作為實驗對照，其中男3例，女2例，年齡1～3個月。結腸造瘺術患兒術后病理檢查確定腸壁肌間和黏膜下神經叢內神經節(jié)細胞發(fā)育正常。研究所用標本均取自手術中切除腸管，并經醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2主要試劑與儀器NADPH-d、氮藍四唑(nitro-blue tetrazolium，NBT)購自美國Sigma公司，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)、Triton x-100購自北京索萊寶公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自美國MP Biomedicals公司，二甲苯購自天津市致遠化學試劑有限公司，303-0型臺式培養(yǎng)箱購自北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.3標本切片及分組對HD患兒的腸管擴張段、痙攣段標本進行常規(guī)冰凍連續(xù)切片，片厚4～5 μm，用普通載玻片貼片，奇數(shù)切片進行NADPH-d酶組織化學染色(NADPH-d染色組)，偶數(shù)切片進行冰凍切片HE染色(HE染色組)。同時將結腸造瘺患兒的切除腸管標本進行常規(guī)冰凍連續(xù)切片，片厚4～5 μm，用普通載玻片貼片，待NADPH-d染色組標本切片進行NADPH-d酶組織化學染色觀察時，將奇數(shù)切片做實驗陽性對照，偶數(shù)切片做實驗陰性對照。

1.4NADPH-d酶組織化學染色觀察神經節(jié)細胞NADPH-d染色反應液組成：1 mL 0.1 mol·L-1PBS(pH 8.0)中加入NADPH-d 0.5 mg、NBT 0.6 mg、二甲基亞砜10 μL、Triton x-100 3 μL。NADPH-d染色組標本切片和實驗陽性對照切片滴加上述反應液約100 μL，置于孵育盒內放入37 ℃培養(yǎng)箱中，8～10 min后先取出實驗陽性對照切片，在顯微鏡下觀察神經節(jié)細胞顯示清晰后，將NADPH-d染色組標本切片全部取出，用PBS沖洗終止反應，并用水性封片劑封片，在顯微鏡下觀察神經叢及神經節(jié)細胞的染色情況。為判斷神經叢所在位置及與冰凍切片HE染色結果進行對比，NADPH-d染色組標本切片進行NADPH-d 酶組織化學染色并在顯微鏡下觀察神經叢及神經節(jié)細胞的染色情況、采集圖像后，再進行冰凍切片HE染色復染，然后再次采集圖像，存檔后觀察分析。實驗陰性對照切片用NADPH-d酶組織化學染色方法染色，其反應液組成：NBT 0.6 mg、二甲基亞砜10 μL、Triton x-100 3 μL。此反應液中不加入NADPH-d，其他實驗條件及步驟同NADPH-d染色組，以排除其他因素對實驗的影響。

1.5快速冰凍HE染色觀察神經節(jié)細胞HD患兒HE染色組標本冰凍切片置于室溫下干燥 2～3 min，用體積分數(shù)95%乙醇固定4～5 min，自來水清洗2 min，蘇木精染色3～4 min，自來水清洗 2 min，伊紅染色20～30 s，體積分數(shù)70%、85%、95%、95%、100%、100%梯度乙醇各放置30 s，二甲苯Ⅰ及二甲苯Ⅱ各放置5～8 min使切片組織透明，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察神經節(jié)細胞。

1.6判定標準(1)NADPH-d染色：HD患兒NADPH-d染色組擴張段標本及實驗陽性對照標本，在低倍鏡下腸壁肌間可見豐富的藍紫色神經叢呈串珠狀分布，高倍鏡下神經叢內可見藍紫色神經節(jié)細胞，其細胞體積大，細胞核空白無著色，細胞質呈藍紫色；NADPH-d染色組痙攣段和實驗陰性對照標本切片神經叢無著色；(2)HE染色：HD患兒HE染色組擴張段標本低倍鏡下見肌間及黏膜下神經叢，神經節(jié)細胞隱約可見，高倍鏡下神經叢內可見體積較大的神經節(jié)細胞，其細胞質豐富，核清晰可見，核內可見明顯核仁；HD患兒HE染色組痙攣段神經叢內不出現(xiàn)神經節(jié)細胞。

1.7統(tǒng)計學處理應用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，2種不同染色組診斷結果組間比較采用配對χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1NADPH-d染色組和HE染色組診斷結果比較結果見表1。37例患兒中，NADPH-d染色診斷陽性36例(97.3%)，陰性1例(2.7%)；HE染色診斷陽性34例(91.9%)，陰性3例(8.1%)；2種染色方法均診斷陽性或陰性者分別為34例、1例，另2例NADPH-d染色診斷陽性者HE染色診斷為陰性；2種染色方法的診斷結果比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.059，P>0.05)。

表1HD患兒腸管標本NADPH-d酶組織化學染色與HE染色診斷結果比較

Tab.1ComparisonofdiagnosticresultofNADPH-dandHEstainingtechnique

NADPH?d染色組HE染色組+-合計+34236-011合計34337

2.2NADPH-d染色組染色情況NADPH-d染色組擴張段標本低倍鏡下觀察可見呈串珠狀分布的神經叢樣結構(圖1A)，高倍鏡下可見細胞質著紫藍色、細胞核空白無著色的細胞(圖1B)；NADPH-d酶組織化學染色后進行HE復染顯示原先串珠狀分布的紫藍色組織為肌間神經叢(圖1C)，黏膜下未見著紫藍色的神經叢；高倍鏡下可清楚分辨核大、深染、細胞質略呈藍色的神經節(jié)細胞(圖1D) 。NADPH-d染色組痙攣段鏡下見背景清晰，無任何著色，未見神經叢及神經節(jié)細胞(圖1E)。實驗陽性對照染色結果同擴張段(圖1F)，實驗陰性對照不著色(圖1G)。

A：NADPH-d染色組擴張段，神經叢呈串珠狀分布(×100)；B：NADPH-d染色組擴張段，神經節(jié)細胞質顯紫色，細胞核空白無著色(×200)；C：NADPH-d染色組擴張段HE復染，可見串珠狀分布的紫藍色肌間神經叢(×100)；D：NADPH-d染色組擴張段HE復染，可見核大、深染的神經節(jié)細胞(×200)；E：NADPH-d染色組痙攣段，背景清晰，未見神經節(jié)細胞(×100)；F：實驗陽性對照標本(×100)；G：實驗陰性對照標本(×100)。

圖1結腸組織NADPH-d染色

Fig.1NADPH-dstainingofcolonictissue

2.3HE染色組染色情況HE染色組擴張段標本肌間神經叢內隱約可見神經節(jié)細胞 (圖2A、B)；HE染色組痙攣段肌間及黏膜下可見分布雜亂的神經叢，其間無神經節(jié)細胞(圖2C、D)。

A：HE染色組擴張段，可見神經叢(×100)；B：HE染色組擴張段，隱約可見神經節(jié)細胞(×200)；C：HE染色組痙攣段，可見神經叢結構(×100)；D：HE染色組痙攣段，神經叢內未見神經節(jié)細胞(×200)。

圖2結腸組織HE染色

Fig.2HEstainingofcolonictissue

3 討論

先天性巨結腸是一種多基因遺傳病[4]，HD是嬰幼兒常見且嚴重的消化道畸形之一，全球發(fā)病率約為1/5 000，其中亞洲人種發(fā)病率較高，為1/3 000～1/2 000，僅次于先天性肛門閉鎖，居第2位[5-6]。20%的患兒在新生兒期因腸梗阻就診[4]，但大部分HD患兒就診較晚，且因病變導致生長發(fā)育滯后[7]。目前，大多數(shù)國內外學者把3個月以內手術者稱為巨結腸的早期治療[7-8]。胚胎時期腸神經系統(tǒng)異常發(fā)育導致神經節(jié)細胞在遠端腸管的異?；蛉比绫徽J為是HD發(fā)病的主要原因[9]。HD的診斷依據(jù)是遠端病變腸壁肌間與黏膜下層神經節(jié)細胞缺如，手術切除病變腸管是唯一療效確切的根治方法。由于在神經嵴細胞發(fā)育的過程中，受多種因素的影響，神經節(jié)細胞可能發(fā)育不成熟甚至完全未發(fā)育[10-11]，對于嬰幼兒，這種發(fā)育不成熟的神經節(jié)細胞更常見，在術中冰凍切片HE染色中不易觀察，直接影響診斷準確率。另外，術中快速冰凍HE染色受病理科醫(yī)師主觀判斷的影響較大，有些病例對于經驗不足的病理醫(yī)生更是難以判定，這不僅延長手術時間，也導致腸管切除不充分或過長，對新生兒及小嬰幼兒的不利影響會明顯增加。國外學者MAIA[12]報道，術中快速冰凍HE染色診斷HD與常規(guī)病理檢查的符合率約為89%，這會影響一部分患兒的預后。

NADPH-d能準確標記一氧化氮合酶，此酶釋放內源性一氧化氮，后者可通過腸神經系統(tǒng)使腸管擴張。近年來，許多學者以NADPH-d酶組織化學染色法研究HD有無神經節(jié)細胞腸管中一氧化氮合酶的分布，發(fā)現(xiàn)該方法可對HD進行快速診斷，尤其是對新生兒期HD[13-14]。本研究采用NADPH-d酶組織化學染色法對37例嬰幼兒HD患兒的腸管標本進行染色，發(fā)現(xiàn)36例HD擴張段腸壁肌間神經叢內可見清晰的細胞質呈紫藍色、細胞核空白的細胞；為證實染色細胞的準確性，對組織進行HE復染，證實該細胞為神經節(jié)細胞；而痙攣段腸壁神經叢中均缺乏陽性表達，鏡下背景清晰，無任何著色，未見神經叢及陽性神經節(jié)細胞，與擴張段形成強烈反差，進一步證實痙攣段是由于缺乏一氧化氮合酶使腸管無法擴張而引起痙攣。本研究還發(fā)現(xiàn)，擴張段黏膜下未見陽性神經叢，與其他研究結果一致[13-14]，其原因有待進一步研究。本研究結果顯示，NADPH-d組與HE染色組均診斷陰性為1例，均診斷陽性為34例，2種染色方法的陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義，但NADPH-d染色試驗時間僅為 8～10 min，而HE染色試驗需30 min，因此，本研究提示，NADPH-d酶組織化學染色法適用于術中快速診斷嬰幼兒HD，其最大優(yōu)勢在于診斷時間短且陽性結果易識別，結合術中快速HE染色法可以提高HD的診斷準確率，幫助確定病變腸管的切除范圍。

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