董 嬌，冀紫陽，谷景陽，邵秋靜，王長虹

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院臨床精神衛(wèi)生學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453002)

隨著生活壓力的增加，抑郁癥發(fā)病率越來越高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，到2020年抑郁癥將成為全球第2大致殘性疾病[1-2]，但目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在抑郁癥尤其是難治性抑郁癥的發(fā)病中起到重要作用[3-4]，而S100B作為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的主要標(biāo)志物，被認(rèn)為是抑郁癥的篩選指標(biāo)，且是表觀遺傳的重要基因[5]。表觀遺傳學(xué)是研究在無細(xì)胞核DNA序列改變的情況下，基因功能的可逆的、可遺傳的改變，DNA甲基化是其最重要的表觀遺傳修飾方式之一。最近的研究顯示，S100B蛋白表達(dá)變化可能取決于S100B基因調(diào)控區(qū)的DNA甲基化程度[6]，而關(guān)于S100B基因甲基化在抑郁癥治療中的作用尚未見報(bào)道。度洛西汀為常用的抗抑郁劑，研究顯示，其能夠激活抑郁模型大鼠海馬和前額葉皮層S100B蛋白活性[7]。本研究通過對大鼠進(jìn)行慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)建立抑郁模型，以選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI)度洛西汀為干預(yù)藥物，從表觀遺傳學(xué)層面探討S100基因甲基化在度洛西汀治療抑郁癥中的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30只清潔級雄性Sprague-Dawle大鼠，體質(zhì)量200～300 g，喂養(yǎng)于濕度40%～50%、溫度(24±1) ℃的獨(dú)立通氣籠系統(tǒng)，自由攝食、水。大鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK (京) 2012-0001，質(zhì)量合格證號：11400700139232。

1.2藥物、試劑與儀器鹽酸度洛西汀腸溶膠囊(美國禮來亞洲公司，批準(zhǔn)文號：H20150287)，血液基因組DNA提取試劑盒DP304(北京天根生化科技有限公司)，引物合成、SK2072-N聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)，D5005 DNA甲基化修飾試劑盒(美國Zymo公司)，DL500DNA Marke(大連寶生工程科技有限公司)；CH20光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，DM2000圖像采集系統(tǒng)(德國徠卡公司)，大鼠DBA-2型程控避暗箱(上海軟隆科技發(fā)展有限公司)，ZF-1B紫外透射分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組30只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、抑郁癥組和度洛西汀組，每組10只。

1.3.2抑郁癥大鼠模型制作抑郁癥組和度洛西汀組大鼠均孤養(yǎng)，并給予42 d CUMS，制備抑郁癥模型；對照組大鼠以每籠3只正常環(huán)境飼養(yǎng)6周，不給予CUMS。CUMS包括：電擊足底(電壓60 V，電流1 mA，每次15 s，間隔35 s刺激1次，共20次)、搖晃鼠籠(頻率為1次·s-1，10 min)、強(qiáng)迫游泳(水溫 4 ℃，水深約35 mm，每次5 min，每日1次)、夾尾(使用大卵圓鉗夾住大鼠尾部近體1/3處，每次 2 min)、熱應(yīng)激(大鼠裝入狹口瓶置于45 ℃恒溫箱5 min)、禁食24 h、禁水24 h、噪音刺激(1 500 Hz，95 dB，每日1 h)、潮濕墊料24 h(將260 mL水加入有鋸末的鼠籠)、120 min行為限制(將大鼠的頭部置于行為限制筒的開口端，不可影響其呼吸)。以上各種刺激隨機(jī)排列，每種刺激使用少于3次，且同種刺激不可以連續(xù)出現(xiàn)，使大鼠不能預(yù)測刺激的發(fā)生。

1.3.3藥物干預(yù)度洛西汀組大鼠于實(shí)驗(yàn)第22～42天的7：30給予度洛西汀7.5 mg·kg-1·d-1(溶于1 mL生理鹽水中)灌胃，連續(xù)治療21 d。對照組和抑郁癥組大鼠不給予任何干預(yù)。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1大鼠行為學(xué)評估分別于造模前(實(shí)驗(yàn)前)、造模后(實(shí)驗(yàn)第21天)及藥物干預(yù)后(實(shí)驗(yàn)第42天)對3組大鼠進(jìn)行體質(zhì)量測定、曠場實(shí)驗(yàn)及避暗實(shí)驗(yàn)，評估大鼠行為學(xué)變化。(1)體質(zhì)量。(2)曠場實(shí)驗(yàn)：先將大鼠放入場箱正中的方格內(nèi)，觀察并記錄5 min內(nèi)大鼠水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)評分。大鼠穿越底面方格數(shù)為水平運(yùn)動(dòng)分?jǐn)?shù)，4只爪均進(jìn)入同一個(gè)方格內(nèi)計(jì)1分，但若大鼠沿著線走，每走10 cm計(jì)1分。以大鼠后肢直立次數(shù)為垂直運(yùn)動(dòng)分?jǐn)?shù)，大鼠2只前爪抬起或抓附箱壁，離開箱底1 cm為準(zhǔn)，待大鼠放下前爪才可計(jì)1分。曠場實(shí)驗(yàn)于8：00～12：00 進(jìn)行，保持房間安靜，每次都由相同的2人觀察記錄。每只大鼠觀測后要打掃干凈箱底，才可進(jìn)行下一只大鼠的觀測。(3)避暗實(shí)驗(yàn)：大鼠DBA-2型程控避暗箱有2間反應(yīng)箱，可分為明箱和暗箱，箱間隔板上有1個(gè)直徑3 cm的圓形洞口，明箱和暗箱底部都裝有銅柵，暗箱底部銅柵通36 V的電刺激，明箱底部則不通電，訓(xùn)練時(shí)將大鼠放入明室中，先適應(yīng)環(huán)境3 min，然后通電，大鼠因嗜暗性鉆入暗室進(jìn)而遭受到電擊，此時(shí)大鼠可從暗室自行逃回明室，獲得記憶，如此訓(xùn)練5 min；24 h后重新開始測試，測試時(shí)先通電，然后將大鼠放入明室，同時(shí)開始計(jì)時(shí)間，記錄從大鼠放入明室至第1次進(jìn)入暗室遭到電擊的時(shí)間(即為潛伏期)。

1.4.2DNA甲基化的檢測(1)標(biāo)本采集：3組大鼠最后一次行為評估后給予100 g·L-1水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉，將其固定在手術(shù)臺上，快速斷頭，取右半球海馬和前額葉皮質(zhì)組織置入收集管中，液氮中保存，備用。(2)提取樣品基因組DNA：液氮冰凍研磨組織樣品后經(jīng)反復(fù)離心，最后收集溶液于EP管中，提取的DNA樣本于-20 ℃保存。(3)基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾：將20 μL DNA樣品和130 μL CT Conversion reagent添加到PCR管中，充分混勻，98 ℃放置10 min，64 ℃放置2.5 h，添加600 μL的M-結(jié)合緩沖液至Zymo-Spin IC柱中，將Zymo-Spin IC柱放入收集管中，充分混合樣品，全速(>10 000 r·min-1)離心30 s，除去流出液，添加100 μL的M-洗滌緩沖液(M-Wash Buffer)到Zymo-Spin IC柱中，12 000 r·min-1離心30 s，添加200 μL的M-脫磺化緩沖液至Zymo-Spin IC柱中，室溫(20～30 ℃)下放置15～20 min，培養(yǎng)后12 000 r·min-1離心30 s，再重復(fù)2次添加 200 μL 的M-洗滌緩沖液到Zymo-Spin IC柱中，12 000 r·min-1離心30 s，最后添加10 μL的M-洗脫緩沖液到Zymo-Spin IC柱基質(zhì)中，將Zymo-Spin IC柱放置于 1.5 mL 的離心管中，12 000 r·min-1離心30 s洗脫DNA；處理過的DNA 可立即進(jìn)行分析或-70 ℃冰箱保存待測。(4)甲基化特異性PCR：S100B甲基化特異性引物序列：上游為5′-TTAGTTTTAGTTACGGATAGATGCG-3′，下游為5′-CACAAAAAA-AATACTAAAAATCGAA-3′；S100B非甲基化特異性引物序列：上游為5′-TAGTTTTAGTTATGGATAGATGTGG-3′，下游為5′-CACAAAAAAAATACTAAAAATCAAA-3′。PCR總反應(yīng)體系為50 μL，Sterilized ddH2O 25 μL，2×PCR Master 22 μL，DNA模板 1 μL，上游引物(10 μmol·L-1) 2 μL，下游引物(10 μmol·L-1) 2 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃40 s，72 ℃ 50 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。(5)25 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳：PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳 40 min，經(jīng)紫外透射分析儀觀察電泳結(jié)果，DM2000圖像采集系統(tǒng)攝取圖像，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.13組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較結(jié)果見表1。造模前3組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對照組大鼠造模前、造模后及干預(yù)后曠場實(shí)驗(yàn)中水平運(yùn)動(dòng)評分、垂直運(yùn)動(dòng)評分及避暗實(shí)驗(yàn)中潛伏期比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與造模前比較，造模后抑郁癥組、度洛西汀組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)中水平運(yùn)動(dòng)評分、垂直運(yùn)動(dòng)評分減少，避暗實(shí)驗(yàn)中潛伏期延長，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。造模后抑郁癥組與度洛西汀組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對照組比較，造模后抑郁癥組、度洛西汀組大鼠體質(zhì)量降低，曠場實(shí)驗(yàn)中水平運(yùn)動(dòng)評分、垂直運(yùn)動(dòng)評分減少，避暗實(shí)驗(yàn)中潛伏期延長，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與造模后比較，干預(yù)后度洛西汀組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)中水平運(yùn)動(dòng)評分、垂直運(yùn)動(dòng)評分增加，潛伏期縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與抑郁癥組比較，干預(yù)后度洛西汀組大鼠體質(zhì)量及曠場實(shí)驗(yàn)中水平運(yùn)動(dòng)評分、垂直運(yùn)動(dòng)評分增加，潛伏期縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表13組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)比較

組別n體質(zhì)量/g水平運(yùn)動(dòng)評分垂直運(yùn)動(dòng)評分潛伏期/s對照組10 造模前201．2±7．887．9±5．423．3±3．913．1±5．3 造模后296．7±10．191．8±4．924．3±6．218．2±7．1 干預(yù)后395．0±8．285．3±8．023．4±4．313．1±8．0抑郁癥組10 造模前205．2±6．489．6±7．322．3±4．112．4±8．6 造模后267．1±6．4a14．1±5．3ab12．3±5．1ab75．4±10．0ab 干預(yù)后321．3±9．1a9．2±6．1a6．9±4．1a76．4±8．8a度洛西汀組10 造模前204．4±6．690．0±6．822．1±4．811．4±8．7 造模后254．8±5．3a13．4±5．7ab13．1±4．3ab78．7±9．3ab 干預(yù)后364．8±12．0c85．8±5．2cd22．2±6．1cd42．9±6．1cd

注：與對照組比較aP<0.05；與造模前比較bP<0.05；與抑郁癥組比較cP<0.05；與造模后比較dP<0.05。

2.23組大鼠海馬及前額葉皮質(zhì)中S100B基因甲基化比較結(jié)果見圖1和圖2。3組大鼠海馬及前額葉皮質(zhì)中所提取的S100B基因均未檢出甲基化條帶。

注：M：甲基化；U：非甲基化；A：對照組；B：抑郁癥組；C：度洛西汀組。

圖13組大鼠海馬組織中S100B基因甲基化

Fig.1MethylationofS100Bgeneinthehippocampusofratsinthethreegroups

注：M：甲基化；U：非甲基化；A：對照組；B：抑郁癥組；C：度洛西汀組。

圖2前額葉皮質(zhì)中S100B基因甲基化

Fig.2MethylationofS100Bgeneintheprefrontalcortexofratsinthethreegroups

3 討論

抑郁癥的發(fā)病機(jī)制主要與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)減少、下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸功能紊亂、神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌失調(diào)、炎癥反應(yīng)等因素有關(guān)，但其確切機(jī)制尚不明確[8]。研究表明，各種應(yīng)激性生活事件特別是長期的慢性壓力與抑郁癥的發(fā)生有一定的正相關(guān)性[9]，而抗抑郁劑可以糾正這種抑郁癥狀[10]。

目前，國內(nèi)外廣泛應(yīng)用CUMS制備抑郁癥動(dòng)物模型，使其發(fā)病機(jī)制與人類抑郁癥更加相近[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CUMS刺激21 d后，大鼠表現(xiàn)出體質(zhì)量增長緩慢、運(yùn)動(dòng)能力下降、學(xué)習(xí)和記憶能力下降(避暗實(shí)驗(yàn)潛伏期延長)等抑郁癥表現(xiàn)，表明成功建立了抑郁模型。與抑郁癥組比較，度洛西汀組大鼠在造模成功后干預(yù)21 d，其運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，學(xué)習(xí)和記憶能力提高，表明抑郁癥表現(xiàn)得到改善，說明度洛西汀能夠改善抑郁模型大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)。

S100B主要由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌，CUMS可造成神經(jīng)元損傷并使S100B表達(dá)升高，影響海馬及前額葉皮層的神經(jīng)再生及可塑性，這種影響在有利的環(huán)境中可增強(qiáng)治療效果，在惡劣的環(huán)境中可增加精神疾病的風(fēng)險(xiǎn)[12]。RONG等[13]研究認(rèn)為，S100B蛋白可能通過影響星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌而在抑郁癥發(fā)生及抗抑郁劑治療中發(fā)揮重要作用。但有研究者認(rèn)為，S100B表達(dá)升高雖然可能是重度或急性抑郁癥的生物學(xué)標(biāo)志物，但其水平可能與抑郁癥的嚴(yán)重程度無相關(guān)性，治療后S100B表達(dá)水平有相應(yīng)的波動(dòng)，但并不能反映治療的臨床療效變化[14-16]。王國棟等[17]研究認(rèn)為，抗抑郁劑可以逆轉(zhuǎn)抑郁大鼠海馬組織內(nèi)S100B高表達(dá)，但并非其抗抑郁作用機(jī)制。

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