張建斌 閔偉偉 李鴻偉 馬志紅 戴利成

中國癌癥統(tǒng)計最新數(shù)據(jù)顯示，2015年我國預(yù)計新發(fā)癌癥病例429.2萬，癌癥死亡病例 281.4萬，全球惡性腫瘤相關(guān)死因中肺癌占27%，僅中國的病例就占1/3以上[1－2]。低劑量螺旋CT的廣泛應(yīng)用極大提高了早期肺癌的檢出率，但一定程度上增加了過度輻射暴露的風(fēng)險[3]。因此，探索外周血指標(biāo)用以診斷腫瘤成為了研究熱點(diǎn)。有文獻(xiàn)報道，miRNA－4286在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者組織中異常表達(dá)[4]，提示miRNA－4286表達(dá)水平可能與NSCLC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。本研究通過實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測NSCLC患者外周血中miRNA－4286表達(dá)水平，進(jìn)一步探討其在NSCLC診斷中的臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇2014年10月至2015年5月行肺癌根治性切除的NSCLC患者31例（觀察組），其中男18 例，女 13 例，年齡 36～81（57.06±10.22）歲；腫瘤部位：左上肺7例（22.6%），左下肺6例（19.4%），右上肺7例（25.8%），右中肺 3例（9.7%），右下肺 7例（22.6%）；腫瘤直徑：（2.43±0.13）cm；病理類型：鱗癌 10 例（32.3%），腺癌 18例（58.1%），其他包括腺鱗癌、大細(xì)胞癌及基底細(xì)胞癌各1例，共3例（9.7%）。選擇同期肺部良性腫瘤手術(shù)患者20例為良性對照組，其中男12例，女 8 例，年齡 45～79（63.1±8.1）歲；腫瘤部位：左上肺 4例（20.0%），左下肺2例（10.0%），右上肺7例（35.0%），右中肺3例（15.0%），右下肺4例（20.0%）；腫瘤直徑：（2.05±0.24）cm。選擇同期健康體檢者21例為陰性對照組，其中男 13 例，女 8 例，年齡 43～80（59.4±9.6）歲。3組患者性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 方法 分別采集兩組空腹血5ml保存，每份血液樣本重復(fù)3次試驗(yàn)。

1.2.1 主要檢測試劑及儀器 實(shí)時熒光定量通用試劑（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）、FTC3000實(shí)時熒光定量PCR儀 （上海楓嶺生物技術(shù)有限公司）、miRNA－4286引物序列 Has－miR－4286－FO：5′－TCTCCTGCACCCCACTCC－3′、Has－miR－4286－RE：5′－TATGGTTGTTCAC GACTCCTTCAC－3′、內(nèi)參基因引物序列 Cel－mir－39－FO：5′－CGTCGATCACCGGGTGTAAA－3′、Cel－mir－39－RE：5′－TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC－3′。

1.2.2 檢測方法 3組患者均在入院時采集空腹靜脈血3.5ml，1600r/min離心10min，吸取上清液1.5ml置于離心管中，再次于1600r/min離心10min，吸取上清液350ml，置于離心管中并于－80℃冰箱中保存；觀察組于術(shù)后第7天清晨再次抽取空腹靜脈血3.5ml，重復(fù)上述步驟。

采用Trizol裂解液裂解組織并提取總RNA，RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 3min，40 個循環(huán)（95℃，12s；62℃，30s；72℃，30s）。miRNA－4286 相對含量以 ΔCT 及 2－ΔΔCT計算，完成后進(jìn)行蛋白電泳檢測PCR產(chǎn)物大小及完整性。PCR反應(yīng)體系見表1。

表1 PCR反應(yīng)體系

1.2.3 計算方法 miRNA－4286相對表達(dá)水平以ΔCT表示，ΔCT=（CT內(nèi)參基因－CT目標(biāo)基因），CT 值即循環(huán)閾值，指反應(yīng)體系中熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。手術(shù)前后兩組配對資料中miRNA－4286相對表達(dá)差異以 2－ΔΔCT表示，2－ΔΔCT＞1 表示目的基因表達(dá)上調(diào)，2－ΔΔCT＜1表示目的基因表達(dá)下調(diào)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗(yàn)，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA檢測結(jié)果 以目標(biāo)RNA逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板擴(kuò)增的熔解曲線單一峰，說明引物合格，無非特異擴(kuò)增；以水為模板擴(kuò)增的熔解曲線沒有峰或只有引物二聚體的小峰，說明體系沒有污染。詳見圖1。

圖1 目標(biāo)基因Has-miR-4286熔解曲線及（a）內(nèi)參基因Cel-mir-39熔解曲線（b）

2.2 PCR產(chǎn)物大小及完整性檢測結(jié)果 電泳結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物大小正確，無雜帶，說明無非特異性擴(kuò)增；電泳結(jié)果的陰性對照顯示沒有目的帶，說明體系沒有污染。詳見圖2。

2.3 觀察組術(shù)前及術(shù)后1周外周血miRNA－4286表達(dá)水平比較 觀察組術(shù)后miRNA－4286表達(dá)水平為ΔCT=－11.179±1.296，較術(shù)前（－15.423±3.631）明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=－13.598，P＜0.05）。觀察組手術(shù)前后配對分析顯示93.5%的患者術(shù)后該基因表達(dá)上調(diào)（2－ΔΔCT值＞1），6.5%的患者術(shù)后該基因表達(dá)下調(diào)（2－ΔΔCT值＜1）。

2.4 3組外周血miRNA－4286表達(dá)水平比較 觀察組術(shù)前 ΔCT=－15.423±3.631，低于良性對照組（－9.014±0.995）和陰性對照組（－9.459±1.019），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=－16.032、－14.021，均P＜0.05）；良性對照組與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.455，P＞0.05）。

圖2 Has-miR-4286擴(kuò)增PCR產(chǎn)物電泳圖（a）及Cel-mir-39擴(kuò)增PCR產(chǎn)物電泳圖（b）

3 討論

miRNA是一種長度約19～22nt的內(nèi)源性非編碼RNA（ncRNA），依靠自身序列的特異性，通過抑制翻譯或裂解RNA轉(zhuǎn)錄的方式來調(diào)節(jié)靶蛋白表達(dá)[5]。外周血中minRNA主要存在于凋亡或壞死細(xì)胞的外泌體和凋亡小體中，能保持較高的穩(wěn)定性，因此對癌癥診斷、預(yù)測預(yù)后有相當(dāng)大的潛力[6]。自上世紀(jì)90年代以來，發(fā)現(xiàn)的miRNA已超過一千種，其中超過半數(shù)被證明與特定的腫瘤有密切關(guān)系；不同種類的miRNA在不同腫瘤中也扮演著不同角色（癌基因或抑癌基因）[7－8]。

miRNA－4286最早是Goff[9]研究人胚胎干細(xì)胞（hESC）早期分化過程時發(fā)現(xiàn)的，我們通過前期RNA芯片實(shí)驗(yàn)中篩選出來具有表達(dá)差異性的新型miRNA，它定位于人類染色體8p23.1，堿基序列為5′－ACCCCACUCCUGGUACC－3′，目前國內(nèi)外報道較少。國內(nèi)有學(xué)者通過檢測血清前列腺特異性抗原（PSA）升高患者miRNA－4286的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)miRNA－4286在前列腺癌中呈高表達(dá),與PSA在前列腺癌中的診斷效能比較，其靈敏度為68.75%，特異度為60．06%[10]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miRNA－4286在食管腺癌患者血清中呈高表達(dá)狀態(tài)，且與患者生存率密切相關(guān)，該差異重點(diǎn)表現(xiàn)在HP陰性的患者中[11]。近幾年，國外多項研究表明，miRNA－4286也與大腸癌、黑色素瘤等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[12－14]。

本研究選取了31例NSCLC患者、20例良性腫瘤患者及21例健康體檢患者，對其外周血中miRNA表達(dá)水平分別進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)觀察組中NSCLC患者術(shù)后較術(shù)前miRNA－4286表達(dá)水平明顯上調(diào)，觀察組術(shù)前與良性對照組和陰性對照組比較差異也有統(tǒng)計學(xué)意義。分析原因?yàn)椋海?）miRNA－4286在NSCLC發(fā)生中發(fā)揮著類似抑癌基因的作用；（2）NSCLC患者外周血中可能存在某種抑制性上游物質(zhì)，發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用以減少miRNA－4286表達(dá)。此外，觀察組術(shù)后miRNA－4286表達(dá)水平較良性對照組及陰性對照組更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明NSCLC患者術(shù)后目標(biāo)RNA表達(dá)水平并未上升至正常，這可能與肺癌患者存在一定量循環(huán)腫瘤細(xì)胞有關(guān)。miRNA－4286在良性腫瘤組（－9.014±0.995）與陰性對照組（－9.459±1.019）之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)合以上結(jié)果，筆者認(rèn)為目標(biāo)RNA可能與腫瘤的局部侵襲能力和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力有更強(qiáng)的相關(guān)性。

總之，miRNA－4286在NSCLC患者外周血中低表達(dá)，而術(shù)后患者、良性患者和健康人群則進(jìn)一步上升，可以推測，目標(biāo)RNA在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中可能作為一種抑癌基因來調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。然而，miRNA－4286在NSCLC中發(fā)揮其抑制作用的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究，而且腫瘤在其發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)生miRNA表達(dá)譜的改變[15]，miRNA－4286是否也存在這種階段特異性同樣值得深入研究。

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