閆李俠 黃至澄 徐黔寧 楊再興 仲人前

已知重要致腹瀉大腸埃希菌有產(chǎn)腸毒素性大腸埃希菌（ETEC）、致病性大腸埃希菌（EPEC）、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌（STEC，曾名為腸出血性大腸埃希菌EHEC）、腸侵襲性大腸埃希菌（EIEC）、腸聚集性大腸埃希菌（EAEC）、細(xì)胞脫落性大腸埃希菌（或細(xì)胞致死膨脹性大腸埃希菌，DAEC）等。對(duì)于腹瀉患者的大便培養(yǎng)，國內(nèi)大多數(shù)醫(yī)院只作幾種傷寒沙門菌、痢疾志賀菌、真菌的鑒定和報(bào)告，但實(shí)際工作中由這幾種細(xì)菌引起的腹瀉只占腹瀉患者的極少部分，大部分腹瀉患者的病原學(xué)尚不能明確，其中致腹瀉性大腸埃希菌占有非常重要的比例[1-3]。常規(guī)應(yīng)用的細(xì)菌培養(yǎng)和鑒定手段難以鑒別多種致腹瀉大腸埃希菌，迫切需要一種快速、靈敏、特異的方法[4-7]。實(shí)時(shí)熒光定量多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）后溶解曲線分析是在同一反應(yīng)體系內(nèi)加上兩對(duì)或兩對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核苷酸片段，根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物溶解曲線的峰值、高度、寬度、面積鑒別不同的致病菌。本研究建立了檢驗(yàn)6種致腹瀉大腸埃希菌多重PCR溶解曲線分析方法，該方法對(duì)診斷和鑒別診斷大腸埃希菌所致的腹瀉具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 菌株 EPEC、EAEC、EIEC、ETEC、EHEC、DAEC 均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC），本研究中所用的其它相關(guān)菌株包括普通大腸埃希菌、副溶血弧菌、福氏志賀菌2a型、福氏志賀菌4型、宋內(nèi)氏志賀菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、阿伯丁沙門菌、甲副傷寒沙門菌等為本實(shí)驗(yàn)室分離保存菌株。

1.2 試劑和儀器 dNTPs、Taq酶、SYBR Green I、Roche Light Cycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀均為羅氏公司產(chǎn)品,批號(hào)為20161211；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌保存和培養(yǎng) 6種致腹瀉性大腸埃希菌及其它相關(guān)菌株加入15%甘油保存于－70℃超低溫冰箱中。培養(yǎng)時(shí)將大腸接種于液體LB培養(yǎng)基中，37℃200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。

1.3.2 DNA模板制備 取過夜培養(yǎng)菌液400μl加入到1.5ml離心管中，12000r/min離心5min，棄上清液，加入400μl去離子水反復(fù)吹打，使沉淀物完全重懸，12000r/min離心5min，棄上清液，加入300μl去離子水吹打混勻，水浴中煮沸10min，迅速放于冰上冷卻1min，13000r/min離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至另1支離心管中－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 引物設(shè)計(jì) 查閱大量國內(nèi)外研究資料，總結(jié)分析致腹瀉大腸桿菌所有毒力基因，在GeneBank中對(duì)比其特異性，選擇特異性最高的毒力基因。將TM值作為第一參考因素，在毒力基因序列中尋找特異性片段作為目標(biāo)基因片段，根據(jù)目標(biāo)基因序列的長度，GC含量，使用最大相鄰法預(yù)測(cè)其TM值，要求TM值在77～95℃并且各不相同，之后用Primer3設(shè)計(jì)特異性的引物，所有引物用Sigma Genosys再次修訂。

1.3.4 單重 PCR 分別以 EPEC、EAEC、EIEC、ETEC、STEC、DAEC為模板，加入相應(yīng)的單一引物對(duì)，使用LightCycler 480熒光定量PCR儀，總體積為25μl，0.5U Taq DNA聚合酶，引物終濃度為0.04～0.56μmol/L。94℃預(yù)變性5 min后，按變性98℃ 50s、退火60℃ 30s、延伸72℃ 30s進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，然后75℃延伸1min，反應(yīng)完成后每隔0.2℃檢測(cè)溶解曲線，根據(jù)空白管熒光去掉背景熒光后，使用軟件自動(dòng)計(jì)算曲線峰值。

1.3.5 多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)及其體系優(yōu)化 以6種菌株混合DNA為模板，分別在同一管中加入2、3、4、5、6、7、8對(duì)引物，參考相關(guān)研究中曾使用過的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，加入緩沖液、Taq聚合酶、SYBR Green I、dNTP，實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)完成后使用TM Calling analysis軟件自動(dòng)分析溶解曲線，初步了解曲線特征，查看有無非特異性擴(kuò)增及交叉反應(yīng)，反復(fù)優(yōu)化反應(yīng)體系，直至可以同時(shí)擴(kuò)增出8種基因片段。（1）Taq酶用量從 0.5～2.0U以 0.5U為梯度遞增，鎂離子（Mg2+）濃度從 1.25×10－3～3.75×10－3mol/L 以 1.25×10－3mol/L 為梯度遞增，致腹瀉大腸埃希菌引物濃度從 0.1×10－6～1.0×10－6mol/L 以 0.2×10－6mol/L 為梯度遞增。（2）循環(huán)條件優(yōu)化，循環(huán)條件 1:step1:預(yù)變性 94℃，30s；step2:變性 94℃，30s；退火60℃,20s；延伸72℃ 30s；35cycles。循環(huán)條件 2:step1: 預(yù)變性 94℃，30s；step2: 變性 94℃，30s；退火55℃，20s，延伸 72℃，20s，35cycles。比較退火溫度的不同對(duì)擴(kuò)增效率的影響。

1.3.6 多聯(lián)熒光PCR的檢出限測(cè)定 將致腹瀉大腸埃希菌增菌液培養(yǎng)8h后分別稀釋為10－4～10－85個(gè)濃度梯度，從各濃度取50μl菌液分別涂HE瓊脂平板，各涂3個(gè)，同樣取各濃度菌液10μl作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)平板上長出的菌落個(gè)數(shù)，結(jié)合相對(duì)應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算出該檢測(cè)方法的檢出限。

1.3.7 多重PCR反應(yīng)特異性檢測(cè) 以非致腹瀉性大腸桿菌，其他常見腸道致病菌包括副溶血弧菌、福氏志賀菌2a型、福氏志賀菌4型、宋內(nèi)氏志賀菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、阿伯丁沙門菌、甲副傷寒沙門菌等的DNA為模板加入8對(duì)種大腸埃希菌特異性引物，其他反應(yīng)參數(shù)參考上述研究結(jié)果，分析擴(kuò)增結(jié)果，計(jì)算特異性百分比。

2 結(jié)果

2.1 毒力基因篩選和引物設(shè)計(jì) 通過反復(fù)多次PCR實(shí)驗(yàn)，最終確定使用表1中8種不同毒力基因作為本研究中的目標(biāo)基因，并設(shè)計(jì)8對(duì)引物。詳見表1。

2.2 單重PCR溶解曲線分析 最終確定，反應(yīng)體系為表格2時(shí)，反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃ 30s、變性94℃ 30s、退火60℃ 20s、延伸72℃ 30s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，75℃延伸10min時(shí)，PCR溶解曲線效果最佳。針對(duì)6種致腹瀉大腸獲得了特異性的溶解曲線，分別見圖1－6。8種特異性基因的PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳再次驗(yàn)證，見圖7。

表1 毒力基因的片段長度、引物序列、TM值、多重PCR時(shí)的引物濃度

表2 單重PCR反應(yīng)體系（μl）

圖1 EPEC溶解曲線

圖2 STEC溶解曲線

圖3 ETEC溶解曲線

圖4 EIEC溶解曲線

圖5 DAEC溶解曲線

圖6 EAEC溶解曲線

圖7 8種基因的瓊脂糖凝膠電泳

2.3 多重PCR及體系優(yōu)化 通過反復(fù)大量實(shí)驗(yàn)，成功確定了多重PCR擴(kuò)增的優(yōu)化組合。多重PCR后的溶解曲線見圖8。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)EIEC、DAEC均能擴(kuò)增出ipaH、daaD這兩種基因片段，因此如果這兩種致腹瀉性大腸同時(shí)存在時(shí)，溶解曲線無法鑒別。其中5種EPEC、EAEC、ETEC、STEC、EIEC 或 DAEC 致腹瀉性大腸可得到明確鑒別。

圖8 多重PCR反應(yīng)后的溶解曲線（8種不同特異性基因的溶解曲線從左到右分別為：aggR,st,eaeA,lt,stx1,stx2,ipaH,and daaD；從左到右依次為EAEC,ETEC,EPEC,STEC,EIEC,或DAEC）

2.4 多重PCR特異性檢測(cè) 分別以非致腹瀉性大腸桿菌，其他常見腸道致病菌等的DNA為模板，擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，特異度為100%。表明所選擇的毒力基因具有很強(qiáng)的特異性。

2.5 多重PCR的檢出限測(cè)定 多重?zé)晒釶CR的檢出限見表3。由于EAEC接種的菌液量是50μl，10-5倍稀釋后平均長出62個(gè)菌落，而研究中使用的菌液是10μl，該10μl的菌液中理論上含細(xì)菌數(shù)為124個(gè)，那么對(duì)于EAEC PCR反應(yīng)的最低理論極限是124cfu/ml。其余5種致腹瀉大腸的檢出限見表3，因此，研究中一次反應(yīng)檢出陽性細(xì)菌可以達(dá)到個(gè)位細(xì)菌數(shù)。

表3 多重PCR的檢出限

3 討論

溶解曲線分析鑒別不同致病菌的原理：DNA雙鏈解離時(shí)所需要的溫度可以在很大范圍內(nèi)發(fā)生變化，不同的DNA序列，長度不同，GC含量不同就會(huì)有不同的TM值。如長度相同而GC含量不同解鏈時(shí)TM值就有不同；或者長度相同、GC含量相同而GC密度不同也會(huì)有不同的TM值。溶解曲線分析的目的是了解DNA片段的TM值，進(jìn)而根據(jù)TM值的不同鑒定不同的基因型。整個(gè)過程由TM Calling analysis軟件自動(dòng)完成。SYBR Green I與雙鏈DNA緊密結(jié)合時(shí)在530nm處可發(fā)出熒光信號(hào)，溶解曲線分析時(shí)軟件自動(dòng)監(jiān)測(cè)SYBR Green I的熒光值，隨著溫度的增高，雙鏈DNA解離為單鏈，SYBR Green I的熒光信號(hào)隨之減弱，根據(jù)熒光信號(hào)的變化，軟件自動(dòng)計(jì)算出DNA的TM值。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后生成一個(gè)溶解曲線圖和一個(gè)峰圖。溶解曲線圖中可以看到一條隨溫度升高而熒光信號(hào)逐漸降低的下降曲線。峰圖中可以看到在標(biāo)本的TM值處出現(xiàn)一個(gè)峰，根據(jù)峰的高度、寬度、面積及所在位置不同很容易鑒別不同的致病菌。

多重PCR在同一個(gè)反應(yīng)體系中存在多對(duì)引物，每對(duì)引物之間存在著相互競(jìng)爭(zhēng)和抑制、很可能形成引物二聚體等錯(cuò)綜復(fù)雜的情況[8-9]。同時(shí)每對(duì)引物由于退火溫度、擴(kuò)增效率的不同，使得多重PCR反應(yīng)體系內(nèi)擴(kuò)增條件的摸索極為費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，需要通過大量實(shí)驗(yàn)反復(fù)調(diào)整、優(yōu)化各種引物的濃度及其他反應(yīng)參數(shù)，才能使各個(gè)基因片段得到相似的擴(kuò)增效率并減少非特異性的擴(kuò)增。研究在優(yōu)化反應(yīng)體系時(shí)，通過降低長產(chǎn)物的引物濃度同時(shí)增加短產(chǎn)物的引物濃度來增加擴(kuò)增效率，并對(duì)Mg2+濃度等進(jìn)行不斷的調(diào)整，比較擴(kuò)增的效果，把擴(kuò)增效率最高時(shí)的Mg2+濃度作為反應(yīng)體系的最佳濃度。在多重PCR反應(yīng)管中，加入不同濃度的Taq DNA聚合酶，比較不同的Taq酶濃度對(duì)擴(kuò)增效率的影響，確定可獲得清晰曲線的最低Taq DNA聚合酶濃度作為反應(yīng)體系中使用的酶濃度。單重PCR反應(yīng)時(shí)使用的dNTP濃度一般在200μmol/L左右，由于研究中多重PCR反應(yīng)同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的片段，需要的dNTP濃度比單重PCR反應(yīng)要高很多，所以研究中將多重PCR反應(yīng)中的dNTP濃度增加至350μmol/L。通過反復(fù)調(diào)整，最終成功構(gòu)建了8對(duì)引物鑒別6種致腹瀉性大腸的多重PCR快速檢測(cè)方法。本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)EIEC、DAEC均能擴(kuò)增出ipaH、daaD這兩種基因片段，所以如果這兩種致腹瀉性大腸同時(shí)存在時(shí)，溶解曲線無法鑒別，其余5種致腹瀉性大腸可得到明確鑒別，實(shí)際工作中由EIEC，DAEC這兩種大腸同時(shí)導(dǎo)致腹瀉的概率極低，當(dāng)然在以后的實(shí)驗(yàn)中還需繼續(xù)尋找能鑒別這兩種大腸的特異性基因。相關(guān)研究中曾經(jīng)報(bào)道DAEC是EIEC的變種[10]，這些變種預(yù)測(cè)產(chǎn)生幾乎相同的擴(kuò)增大小，GC含量百分比幾乎相同，GC含量分別為60%和58%。預(yù)測(cè)TM值差1℃，實(shí)際TM值差為0.73℃，所以在研究中尚不能將DAEC與EIEC作有效的區(qū)分，至于這兩種大腸ipaH、daaD基因的突變位點(diǎn)具體在什么位置？有幾個(gè)突位點(diǎn)？DAEC與EIEC是否是同種大腸埃希菌的不同株？需進(jìn)一步研究考證。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)6種致腹瀉大腸埃希菌進(jìn)行PCR-HRM分型，共產(chǎn)生8種HRM曲線型，一次反應(yīng)即鑒別5種不同的致腹瀉性大腸埃希菌在國內(nèi)尚為首次。HRM分析要求擴(kuò)增達(dá)到平臺(tái)期后再進(jìn)行，想要得到良好的PCR溶解曲線分型結(jié)果，必須建立標(biāo)準(zhǔn)的系統(tǒng)的操作規(guī)程，并對(duì)不同的PCR-HRM研究摸索出適合各自特點(diǎn)的反應(yīng)參數(shù)[11-12]。

研究中建立的方法適用于純菌落致腹瀉性大腸致病基因的篩查。以純大腸桿菌純菌落作為模板可以減少干擾物質(zhì)對(duì)多重PCR體系的影響，提高實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性。由于傳統(tǒng)血清凝集實(shí)驗(yàn)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，單重PCR又僅能檢測(cè)其中一種大腸，分別檢測(cè)每種大腸的相關(guān)基因，工作效率太低，成本相對(duì)較高。研究建立的多重PCR溶解曲線分析檢驗(yàn)周期為30h，PCR完成后不需要凝膠成像系統(tǒng)、更不需要送專業(yè)測(cè)序公司測(cè)序，節(jié)約了大量時(shí)間，降低了實(shí)驗(yàn)成本。一次性檢測(cè)多種致腹瀉性大腸提高了實(shí)驗(yàn)效率。在腹瀉病與食源性疾病的暴發(fā)調(diào)查和日常監(jiān)測(cè)中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[13-14]。

目前，質(zhì)譜分析技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于臨床微生物的檢驗(yàn)，它可以直接從培養(yǎng)物中挑取菌落進(jìn)行分析鑒定，滿足了臨床上對(duì)細(xì)菌鑒定微量并且快速的要求。如果能開發(fā)PCR-HRM分型技術(shù)并應(yīng)用于臨床標(biāo)本中微生物的鑒定，將PCR-HRM與質(zhì)譜鑒定技術(shù)結(jié)合起來應(yīng)用，將會(huì)大大加快臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)的發(fā)展[15]。

綜上所述，本研究中建立的一管反應(yīng)鑒別6種致腹瀉大腸埃希菌的PCR-HRM分型技術(shù)是一種簡單、快速、高通量、高靈敏度和低成本的新技術(shù)，在SNP和基因突變的檢測(cè)中具有廣闊的應(yīng)用前景，在微生物的分子分型診斷中也將具有重要的地位，有必要進(jìn)行更深入的研究。

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