余銘 施正超 薛迪新 陳澄亮 陳積賢 賀新偉 金凱 孫利敏

大腸癌是常見的人類惡性腫瘤之一，大腸癌患者的生存與預(yù)后一直是醫(yī)療工作者關(guān)注的重點。大腸癌的發(fā)生機制與許多基因相關(guān)，近年來越來越多的研究揭示了大腸癌的發(fā)生、發(fā)展與小分子RNA（microRNA，miRNA）有關(guān)。miRNA是一類非編碼RNA，長度約為20個核苷酸。研究顯示miR－10b在許多腫瘤中諸如乳腺癌、胃癌中表達水平升高[1－2]，但在大腸癌中的表達情況少有報道。HOXD10基因是同源異形盒基因家族的一員，在胃癌中的表達下調(diào)，通過激活Rhoc－Akt信號通路導(dǎo)致癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[3]，有報道在膀胱癌中的表達也下調(diào)[4]，下調(diào)表達的HOXD10基因也促進癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。筆者通過real－time PCR法檢測大腸癌組織中的miR－10b表達和HOXD10mRNA表達情況及其與臨床病理特征的關(guān)系，以期為臨床上診治大腸癌以及預(yù)后分析提供一定的幫助。

1 對象和方法

1.1 對象 收集我院2013年6月至2014年9月53例手術(shù)切除大腸癌患者的癌組織及距離癌組織5cm以上的正常大腸黏膜組織。患者男22例，女31例，年齡41～69歲，平均54.75歲，術(shù)前均未進行放化療，均行大腸癌根治術(shù)，癌組織和癌旁組織標本各取1份，液氮速凍后置于－80°C冰箱中備用。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批并同意。大腸癌的TNM分期依據(jù)美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）指南2015年公布的大腸癌 TMN分期法。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 采用total RNA Extractor（上海生工生物工程有限公司）進行總RNA提取，操作步驟按照說明書。提取的總RNA進行電泳，紫外透射光下觀察并拍照。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA miR－10b和HOXD10mRNA的逆轉(zhuǎn)錄：使用提取后的總RNA，miR－10b加入特異性引物，HOXD10mRNA加入隨機引物，用無RNA酶水定容至 13μl，70°C 溫浴 5min，冰浴 10s后，離心加入 4.0μl反應(yīng)緩沖液，2.0μl dNTP，1.0μl RNA 酶抑制劑，2.0μl逆轉(zhuǎn)錄酶（濃度為 10U/μl），37°C 溫浴 5min，42°C 溫浴60min，70°C 溫浴 10min。停止反應(yīng)。

1.2.3 real－time PCR反應(yīng)體系 將管家基因U6及HOXD10mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA成倍稀釋，做雙標準曲線，兩者的擴增效率相近且均大于0.99。SG Fast qPCR Master Mix（High Rox）（2X）（上海生工生物工程有限公司）10μl，正向引物 0.4μl，反向引物 0.4μl，DEPC處理水 7.2μl，cDNA 模板 20μl。 miR－10b－5p 使用 U6作為內(nèi)參，HOXD10mRNA使用β－actin作為內(nèi)參。PCR循環(huán)條件：初始維持步驟：95℃3min。循環(huán)步驟：熔解95℃ 7s，退火57℃ 10s，延伸72℃ 15s，循環(huán)40次。引物序列如下:管家基因（U6、β－actin）引物序列 U6－F：5′－CTCGCTTCGGCAGCACA－3′，U6－R：5′－AACGCTTCACGAATTTGCGT－3′，H－β－actin－F:5′－TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG－3′，H－β－actin－R:5′－TCACCTTCACCGTTCCAGTTT－3′，miR－10b RT：5′－CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCACAAATT －3′，miR－10b F：5′－ACACTCCAGCTGGGTACCCTGTAGAACCG－3′，All R：TGGTGTCGTGGAGTCG,H－HOXD10－F:5′－ACCTCAAGTAGACAGTTGGACAGA－3′，H－HOXD10－R:5′－AGTCTAAAATATCCAGGGACGG－3′。

1.2.4 免疫組化 采用免疫組化SP法檢測53例大腸癌及其對應(yīng)的正常黏膜組織，53對標本經(jīng)4%甲醛固定、石蠟包埋，以4μm厚連續(xù)切片，一抗采用兔抗人HOXD10多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）。HOXD10蛋白染色于細胞核，呈黃色顆粒，評分標準參照文獻[5]，為十三點法（A×B），其中A為按染色強度計分：3分為黃褐色，2分為棕黃色，1分為淡黃色，0分為不著色。B為按照陽性染色細胞百分率計分：4分為≥76%，3分為51%～75%，2分為 26～50%，1分為 10%～25%，0分為＜10%；陰陽性判斷：A×B，≥6分為陽性，＜6分為陰性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計軟件，計量資料呈偏態(tài)分布，以中位數(shù)及四分位數(shù)間距表示，在大腸癌組織和正常組織中及不同臨床病理特征miR－10b和HOXD10mRNA的表達差異比較采用秩和檢驗；HOXD10蛋白在大腸癌組織與大腸正常黏膜組織中表達陽性率的比較采用χ2檢驗，大腸癌中miR－10b和HOXD10mRNA表達的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 miR－10b和HOXD10mRNA在大腸癌中的表達情況 在53例大腸癌患者中，34例（65.38%）患者miR－10b的表達升高，miR－10b在大腸癌組織中的相對表達水平為1.672（1.167～1.945），大腸正常黏膜組織中的相對表達水平為 0.648（0.215～0.946），miR－10b 在大腸癌組織中的表達水平是癌旁正常組織的2.58倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003）；在53例大腸癌患者中，32例（60.38%）患者的HOXD10mRNA表達下降，HOXD10mRNA在大腸癌中的相對表達水平為0.341（0.134～0.963），大腸正常黏膜組織中HOXD10mRNA的相對表達水平為0.810（0.524～1.027），大腸正常黏膜組織中HOXD10mRNA表達是大腸癌組織的2.378倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001）。

2.2 HOXD10蛋白的表達情況 在53例大腸癌組織中，HOXD10蛋白表達陽性20例（37.7%），而在53例大腸正常黏膜組織中，HOXD10蛋白表達陽性41例（77.4%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=17.030，P＜0.05）。在大腸癌組織中，HOXD10蛋白表達于癌細胞的細胞核中（見圖1）。由圖1A可見，細胞核染色呈黃褐色，染色細胞百分比≥76%，故結(jié)果判定為陽性；由圖1B可見，細胞核染色呈棕黃色，染色細胞百分比0分為＜10%故結(jié)果判定為陰性。

圖1 大腸癌細胞中HOXD10蛋白的表達情況（a：HOXD10蛋白表達陽性；b：HOXD10蛋白表達陰性；免疫組化SP法，×400）

2.3 在不同臨床病理特征大腸癌患者miR－10b和HOXD10mRNA表達水平的比較 見表1。

表1 在不同臨床病理特征大腸癌患者miR-10b和HOXD10mRNA表達水平的比較

由表1可見，有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的miR－10b在大腸癌中的表達水平分別為1.545、1.327，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003）；臨床分期為Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期的大腸癌中miR－10b表達水平分別為1.327、1.545，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001）；miR－10b在不同年齡、性別、腫瘤大小、浸潤深度者之間均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）。有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的HOXD10mRNA在大腸癌患者中的表達水平分別為0.256、0.417，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002）；在大腸癌中臨床分期為I+II期和III+IV期的大腸癌中HOXD10mRNA表達水平分別為0.567、0.216，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）；HOXD10mRNA的表達在不同年齡、性別、腫瘤大小、浸潤深度者之間均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P ＞0.05）。

2.4 miR－10b和HOXD10mRNA在大腸癌中表達的相關(guān)性 在大腸癌組織中，miR－10b和HOXD10mRNA的表達呈負相關(guān)（r=－0.513，P=0.005）。

3 討論

miRNAs是一類小分子非編碼RNA，由20～25個核苷酸組成，在真核生物中被大量發(fā)現(xiàn)，主要通過與mRNA的3′非編碼區(qū)結(jié)合負性調(diào)節(jié)靶基因的表達。近年來許多研究表明miRNAs在許多腫瘤組織中出現(xiàn)異常表達，并與腫瘤的增殖[6]、凋亡[7]、侵襲[8]和轉(zhuǎn)移[9]有關(guān)。

Huang等[10]研究顯示在非小細胞肺癌中，miR－10b表達升高，通過沉默miR－10b后，發(fā)現(xiàn)凋亡誘導(dǎo)因子Fas、FasL、Bax和caspase 3表達升高，凋亡抑制因子Bcl－2和PCNA表達下降。Ma等[11]通過RT－PCR技術(shù)檢測5種不同胃癌細胞系及65對胃癌及其對應(yīng)的胃黏膜組織，發(fā)現(xiàn)miR－10b在胃癌組織中表達上升，上升的miR－10b可能通過下調(diào)Krüppel樣因子4促進胃癌的發(fā)生、發(fā)展。Han等[12]研究顯示在乳腺癌組織中，miR－10b表達明顯上升，研究同時顯示miR－10b在轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF－β1）誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要作用，而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與癌癥的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，故提示miR－10b與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。Nishida等[13]研究顯示miR－10b的表達與結(jié)直腸癌的預(yù)后有關(guān)，高表達的miR－10b更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，Jiang等[14]研究認為結(jié)直腸癌患者升高的miR－10b也可預(yù)測患者的肝轉(zhuǎn)移。本研究顯示在53例大腸癌患者中，34例（65.38%）患者 miR－10b的表達升高，miR－10b在有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌中的表達情況分別為1.545、1.327，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003），提示 miR－10b在大腸癌中的表達升高與轉(zhuǎn)移有關(guān)，這與Nishida[13]與Jiang[14]的研究類似。

HOXD10是HOX家族成員之一，是同源異型盒基因，可編碼轉(zhuǎn)錄因子，識別和結(jié)合特異性的DNA結(jié)構(gòu)域，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，不同的腫瘤組織對應(yīng)不同的HOX家族成員，Kelly等[15]研究顯示在卵巢癌中HOX基因出現(xiàn)異常表達，其中 HOXA13、B6、C13、D1 和D13表達升高，提示不良預(yù)后。Zhang等[16]研究表明在乳腺癌組織及患者的血漿中HOTAIR表達升高，同時發(fā)現(xiàn)血漿中升高的HOTAIR與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示HOTAIR可能成為乳腺癌診斷的潛在指標。Bhatlekar等[17]研究發(fā)現(xiàn)HOXA在乳腺癌及卵巢癌中出現(xiàn)異常表達，HOXB在結(jié)腸癌中表達異常，HOXC在前列腺癌及肺癌中表達異常，HOXD在結(jié)腸癌及乳腺癌中表達異常。Mo等[18]研究顯示在前列腺癌中HOXD10表達下降，敲除HOXD10基因后可促進癌細胞增生。Lin等[19]研究表明結(jié)合血漿中ZIC1、HOXD10及RUNX3甲基化情況可用于診斷早期胃癌及癌前病變。本研究顯示在53例大腸癌患者中，32例（60.38%）患者的HOXD10mRNA表達下降，33例（62.3%）患者的HOXD10蛋白的表達為陰性，而造成HOXD10蛋白和mRNA的表達不完全一致的可能原因是HOXD10mRNA在轉(zhuǎn)錄后水平受miR-10b負性調(diào)控[20-21]，HOXD10mRNA在有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌患者中表達情況分別為0.256、0.417，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002），提示在大腸癌中，HOXD10mRNA表達的下降提示癌腫的轉(zhuǎn)移。

有研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，miR-10b通過作用于HOXD10基因來改變MMP-14和uPAR因子的表達，進而誘導(dǎo)腫瘤的侵襲[20]。Liu等[3]通過對胃癌組織的研究發(fā)現(xiàn)，miR-10b在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中表達明顯上升，同時還發(fā)現(xiàn)miR-10b通過負性調(diào)節(jié)靶基因HOXD10刺激RhoC-AKT通路，促進胃癌細胞的侵襲。在卵巢癌細胞中，過表達的miR-10b通過下調(diào)HOXD10基本的表達，從而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達，如MMP14和RHOC[21]。在膀胱癌細胞中，miR-10b表達升高，并可促進癌細胞的侵襲和遷移，進一步研究顯示升高的miR-10b可能通過miR-10b/KLF4/E-cadherin及miR-10b/HOXD10/MMP14途徑影響癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[22]。

本研究顯示在大腸癌組織中miR-10b表達升高，而HOXD10mRNA表達下降，HOXD10mRNA在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中的表達較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者表達下降，臨床分期Ⅲ和Ⅳ期的患者表達較Ⅰ和Ⅱ期的患者降低，這與類似[23]。miR-10b在浸潤深度T3+T4組中的表達明顯高于浸潤深度在T1+T2組，提示miR-10b的表達與大腸癌的侵襲有關(guān)，miR-10b在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中

較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中表達明顯升高，提示高表達的miR-10b可促進大腸癌的轉(zhuǎn)移，miR-10b在臨床分期Ⅲ和Ⅳ期患者中的表達較Ⅰ和Ⅱ期的患者明顯升高。提示高表達的miR-10b的大腸癌患者預(yù)后可能較差，但還需要進一步的生存分析（目前患者仍在隨訪中），相關(guān)性分析顯示在大腸癌中HOXD10mRNA的表達與miR-10b的表達呈負相關(guān)，提示在大腸癌中HOXD10可能為miR-10b的靶基因，故miR-10b可能為大腸癌的生物治療提供新的靶點。

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