潘壽華 朱智榮

膀胱尿路上皮癌是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，在我國的發(fā)病率逐年上升。目前膀胱癌的發(fā)病機制尚未完全闡明，推測其發(fā)病與多層次的基因紊亂有關[1]。近年來研究表明，微小RNA（miRNA）與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，通過多種機制在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[2－3]。miR－340能調控多種蛋白質的編碼及翻譯，從而調控細胞周期，影響腫瘤浸潤轉移等，被稱為“抑癌基因”。本研究應用基因芯片及定量聚合酶鏈反應（PCR）技術檢測膀胱尿路上皮癌及正常膀胱黏膜組織中的miR－340表達，并通過對miR－340的靶基因預測、基因注釋、功能分析以及信號轉導通路富集等一系列生物信息學分析，為miR－340在膀胱尿路上皮癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用與機制研究提供理論基礎。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2016年1至12月在我院進行膀胱尿路上皮癌外科手術治療的30例患者，男16例，女14 例，年齡 44～79（57.0±8.2）歲。取病變部位和距腫瘤基底部2cm以外的膀胱黏膜組織，新鮮標本離體后，液氮速凍保存，術后病理確診為膀胱尿路上皮癌，其中非浸潤性膀胱組織18例，浸潤性膀胱癌組織12例。腫瘤標本的收集及相關資料的分析得到我院倫理委員會的批準，且所有患者均簽署知情同意書。

1.2miRNA芯片檢測采用Trizol（美國Invitrogen公司）從組織中提取總RNA。用含有0.65%甲醛的1%變性瓊脂糖凝膠測定總RNA的完整性。使用NanoDrop 2000核酸蛋白分析儀（美國Thermo Scientific公司）測定總RNA的質量和濃度。miRNeasy小提試劑盒（德國Qiagen公司），依照說明書操作提取miRNA。使用miRCURYTM Hy3TM/Hy5TM Power標記試劑盒（丹麥Exiqon公司），依照說盒內說明書操作。采用T4 RNA連接酶標記3末端Hy3TM熒光標記1μg RNA，標記后將Hy3TM 標記樣品與 miRCURYTMLNAArray（V.16.0）（丹麥Exiqon公司）芯片雜交。使用Axon Genepix 4000B微列掃描儀對芯片掃描。

1.3 實時定量PCR（qRT-PCR）驗證 qRT-PCR過程按照標準的TaqMan MicroRNA assay（美國Applied Biosystems公司）操作步驟在ABI7700系統(tǒng)（美國Applied Biosystems公司）上進行擴增。擴增條件：95℃5min，隨后 95℃ 10s，60℃ 20s，72℃ 20s，反應 35 個循環(huán)。以U6為內參基因進行校正和標準化。應用GenePix proV6.0（美國Axon公司）進行數據分析。miRNA-340正向引物序列為5'-GCGGTTATAAAGCAATGAGA-3′，反向引物由試劑盒自帶。內參U6正向引物序列為 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物序列為 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.4 miR-340靶基因預測 應用mirecords數據庫（http://mirecords.biolead.org/）進行靶基因預測，在線應用靶基因預測軟件篩選miR-340最可能的靶基因。預測 軟 件 包 括 ：DIANA-microT、MicroInspector、miRanda MirTarget2、miTarget、NbmiRTar、PicTar、PITA、RNA22、RNAhybrid、TargetScan/TargetScanS，統(tǒng)計同時有 3 個生物軟件預測陽性結果的靶基因。

1.5 miR-340靶基因生物信息學分析 miR-340的靶基因集合用 Gene Ontology（GO，http://www.geneontology.org//）進行功能富集分類，GO將基因功能詳細劃分為分子功能（molecular function，MF）、生物學過程（biological process，BP）和細胞組件（cellular component，CC）3 個方面。用BINGO進行GO注釋的顯著性分析，以P＜0.01為顯著性閾值得到具有統(tǒng)計學意義的注釋，從而得到基因集合在GO類別上的分布信息。利用David（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）數據庫對miR-340的預測靶基因集合進行基于KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.genome.jp/kegg/）數據庫的信號通路分析，通過Fish Exact Test計算P值，以P＜0.05為顯著性閾值，得到基因集合中具有統(tǒng)計學意義的信號轉導通路。

1.6 統(tǒng)計學處理 芯片結果用Genepix Pro V6.0（美國Axon公司）進行排序，中位值對表達數據進行標準化，應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計量資料兩組采用Student ttest分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 膀胱尿路上皮癌組織中差異表達的miRNAs 芯片分析結果顯示，與正常膀胱黏膜組織比較，膀胱尿路上皮癌組織中有12個miRNA表達上調（＞2倍），8個miRNA表達下調（＜0.5倍），其中上調4倍以上的miRNA 有 miR-191、miR-17-5p、miR-221、miR-106b，下調 4 倍以上的有 miR-340、miR-145、miR-133a、miR-101，其中 miR-340表現(xiàn)為下調（0.12倍）（P＜0.01）見表1。實時定量PCR檢測膀胱尿路上皮癌組織及正常膀胱黏膜組織中miR-340的表達，結果顯示，與正常膀胱黏膜組織比較，miR-340在膀胱尿路上皮癌組織中表達明顯降低，為正常黏膜膀胱組織的0.12倍（P＜0.01），與芯片結果一致，見圖1。

表1 膀胱尿路上皮癌組織中差異表達的miRNAs

2.2 miR-340靶基因生物信息學分析結果 實驗利 用 DIANA-microT、MicroInspector、miRanda MirTarget2、miTarget、NbmiRTar、PicTar、PITA、RNA22、RNAhybrid、TargetScan/TargetScanS等靶基因在線預測軟件對miR-340進行靶基因預測，同時由3個軟件預測到的靶基因共有179個。將這些預測到的靶基因利用DAVID數據庫進行GO及信號通路的富集分析。結果發(fā)現(xiàn)miR-340預測的靶基因分別富集在cell adhesion、biological adhesion、cell-cell adhesion、cell communication、regulation of cellular component movement和regulation of signal transduction等，見表2。通過DAVID數據庫對miR-340預測的靶基因集合進行基于KEGG通道富集分析，可見靶基因信號通路富集于pathways in cancer、focal adhesion、adherens junction 和 cell cycle等通路（P＜0.05），見表 3。

圖1 膀胱尿路上皮癌組織中miR-340表達為正常黏膜膀胱組織的 0.12 倍（N：normal，T：bladder tumor）

表2 miR-340靶基因的功能富集分析

表3 miR-340靶基因的KEGG通路富集分析

3 討論

miRNA是發(fā)現(xiàn)于真核細胞中的一類長度約為22個核苷酸的內源性非編碼單鏈小RNA分子，miRNA能通過與靶向 mRNA3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR）互補配對，降解靶mRNA或抑制靶mRNA翻譯的機制，在轉錄后水平調控基因的表達，在細胞的增殖、凋亡、分化、代謝等方面發(fā)揮著重要的作用。研究表明，miRNA在多種腫瘤中異常表達，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移中作為抑癌基因或癌基因起重要的作用[4-5]。大量研究已證實在不同的腫瘤組織中有不同的miRNA表達譜，miRNA基因芯片技術已被廣泛地應用于差異表達miRNA的篩選，所揭示的miRNA表達譜可以提供豐富的信息。本研究利用基因芯片技術檢測發(fā)現(xiàn)，與正常膀胱黏膜組織比較，膀胱尿路上皮癌組織中有15個miRNAs表達上調，10個miRNAs表達下調，其中miR-340表達明顯下調，經實時定量PCR證實，miR-340在膀胱尿路上皮癌中明顯低表達，與蕊片檢測結果一致，說明miR-340在膀胱尿路上皮癌中表達明顯下調。

miR-340全長22nt，序列為uuauaaagcaaugagacugauu，編碼miR-340的基因定位在5q35.3的179442303-179442397bp區(qū)域。miR-340能調控多種蛋白質的編碼及翻譯，從而調控細胞周期，影響腫瘤浸潤轉移等，被稱為“抑癌基因”[6]。已證實miR-340在乳腺癌[7]、前列腺癌[8]、骨肉瘤[9]及黑色素瘤[10]等實體腫瘤中表達下調，通過介導腫瘤細胞的侵襲、轉移等過程影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。但miR-340在膀胱尿路上皮癌中的表達至今鮮有報道。本研究證實miR-340在膀胱尿路上皮癌中的表達明顯下調，miR-340在膀胱尿路上皮癌中可能發(fā)揮了抑癌基因的作用。

目前已知miRNA家族是基因表達調控網絡中重要組成部分，可能參與多條信號轉導通路的調控。miRNA靶基因的確定是研究miRNA生物學功能的關鍵，對靶基因的功能分析有助于我們對miRNA作用機制的理解。Goswami等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-340與小眼畸形相關轉錄因子（MIFT）mRNA結合后,下調MIFT的表達并抑制其活性，從而抑制黑素瘤形成。Wu等[7]發(fā)現(xiàn)，miRNA-340通過降低肝細胞生長因子受體（C-MET）和基質金屬蛋白酶（MMP-2、MMP-9）的表達而抑制乳腺癌細胞的侵襲和浸潤。在成神經細胞瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-340可以誘導成神經細胞瘤凋亡[11]。Cai等[9]發(fā)現(xiàn)在小兒骨肉瘤中，miR-340通過ROCK1途徑抑制腫瘤細胞生長與侵襲。在泌尿系腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，miR-340通過MDM2-p53通路抑制前列腺腫瘤細胞增殖與轉移[8]。本研究利用生物信息學方法對miR-340的靶基因進行預測，并對靶基因集合進行功能富集分析和信號轉導通路富集分析，發(fā)現(xiàn)miR-340的靶基因的生物學功能涉及到腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個階段，如轉移酶活性、細胞周期調控、轉錄調控、細胞或基質間黏附以及細胞的分化等，尤其是細胞或基質間黏附功能直接與腫瘤的演進有關[12]。

本研究利用基因芯片技術及實時熒光PCR檢測miR-340在膀胱尿路上皮癌中的表達，并進行靶基因的預測及其功能的生物信息學分析，結果顯示miR-340在膀胱尿路上皮癌組織中的表達是明顯下調的，其靶基因富集于多個生物學過程及與腫瘤相關的信號轉導通路上，miR-340可能通過調控某些靶基因的表達參與調控膀胱尿路上皮癌的發(fā)生與發(fā)展。這些研究有助于提高我們對膀胱尿路上皮癌發(fā)生機制的認識，為進一步研究miR-340在膀胱尿路上皮癌發(fā)生、發(fā)展過程中的機制提供理論依據和實驗基礎。

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