周小明 翁杰 王志翊 龔裕強(qiáng)

肝臟是機(jī)體最大的解毒器官，肝細(xì)胞能量代謝是肝臟解毒功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，肝組織腺苷酸含量的變化直接反映肝臟能量代謝狀況，是評(píng)價(jià)肝臟損害和藥物保護(hù)效果的有效指標(biāo)。目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)組織腺苷酸含量的方法大多時(shí)間慢，過(guò)程復(fù)雜[1－2]。本實(shí)驗(yàn)采用一種改良的反相高效液相色譜（RP－HPLC）法測(cè)定急性溴苯腈中毒小鼠肝組織三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、磷酸腺苷（AMP）含量變化，旨在為研究肝臟能量代謝變化提供較為快速、理想的方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 實(shí)驗(yàn)小鼠由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，24只成年雄性SD大鼠，體重250～300g。老鼠被安置在塑料籠子，提供水和食物，自由攝食。養(yǎng)殖條件為12h光/暗周期，溫度保持在（24±2）℃。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物予禁食12h，不禁水，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為急性中毒組予溴苯腈（97%溴苯腈原藥以10%二甲亞砜為溶媒配成10mg/ml溶液）200mg/kg灌胃染毒和正常對(duì)照組（予10%二甲亞砜溶液20ml/kg灌胃），每組12只，兩組均于灌胃后6h采用脊椎脫臼法處死。

1.2 儀器與試劑 高效液相色譜儀Agilent1100（美國(guó)Agilent公司），高速低溫離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司），ATP、ADP、AMP標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó) Sigma公司），97%溴苯腈原藥（浙江禾本農(nóng)藥化學(xué)有限公司），乙腈（天津四友，色譜純），10%二甲亞砜溶液、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氫氧化鉀、高氯酸(均為國(guó)產(chǎn)分析純），實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.3 色譜條件 日本島津C18ODS色譜分析柱（5μm，200mm×4.6mm），流動(dòng)相A為150mmol/L磷酸二氫鉀溶液+150mmol/L氯化鉀溶液，用2mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)整溶液pH值至6.0；流動(dòng)相B為85%流動(dòng)相A+15%乙腈，所用流動(dòng)相實(shí)驗(yàn)前均經(jīng)0.45μm孔徑的微孔濾膜過(guò)濾，并行超聲脫氣泡處理。洗脫梯度：0min、3%B，5min、9%B，9min、3%B（B指流動(dòng)相B），平衡8min。柱溫為16℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；流速1.1ml/min。

1.4 肝組織樣品的制備 處死兩組小鼠后分離小鼠的肝臟組織。用液氮預(yù)冷的鐵夾鉗取肝組織，置液氮冷凍后，精確稱取肝組織0.3g，加入預(yù)冷的0.3mol/L高氯酸溶液3ml，冰浴中用研缽迅速勻漿，勻漿液6000r/min低溫4℃離心10min，取上清液，予1mol/L的氫氧化鉀調(diào)溶液pH值至6.0，再次6000r/min低溫4℃離心10min，取上清液，經(jīng)0.45μm孔徑的微孔濾膜過(guò)濾，即得肝組織樣本溶液，吸取20μl進(jìn)行分析，測(cè)定肝組織ATP、ADP、AMP 含量。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別稱取ATP、ADP和AMP標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用超純水配成1mg/ml的混合母液，分別稀釋成 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)進(jìn)樣質(zhì)量濃度和測(cè)得的峰面積求取回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.6 加標(biāo)回收率的計(jì)算 肝組織加入一定量的腺苷酸混合標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)沉淀蛋白、中和酸性等處理，測(cè)定腺苷酸含量，與同批處理的同一組織樣品比較，計(jì)算回收率，回收率=(加標(biāo)測(cè)定量-不加標(biāo)測(cè)定量）/加標(biāo)量×100%計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品的回收率。

1.7 精密度的測(cè)量 上述色譜條件下，同日內(nèi)對(duì)同一肝組織樣本不定時(shí)進(jìn)樣6次，測(cè)得日內(nèi)保留時(shí)間與峰面積變異系數(shù)；上述樣品分裝，-70℃保存，不同日進(jìn)樣分析，重復(fù)6次，測(cè)得日間保留時(shí)間與峰面積變異系數(shù)。

1.8 觀察指標(biāo) 觀察并比較兩組小鼠肝細(xì)胞ATP、ADP和AMP含量差異，判斷RP-HPLC法測(cè)定急性溴苯腈中毒小鼠肝組織腺苷酸含量是否符合既往研究結(jié)果，并觀察RP-HPLC法的出峰時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，兩樣本間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 出峰時(shí)間 ATP、ADP和AMP的出峰時(shí)間分別約為5.7、6.3和8.5 min，3種標(biāo)準(zhǔn)腺苷酸分離較滿意，最小分離度R＞2.0，見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 結(jié)果 ATP、ADP和AMP濃度在 1～200mg/L范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，所得直線方程分別為 ATP：y=23.706x-3.3611，R=0.99999；ADP：y=33.549x-15.143，R=0.99998；AMP：y=41.934x-1.6868，R=0.99999。

2.3 加標(biāo)回收率 見表1。

表1 肝組織腺苷酸含量加標(biāo)回收率（μg/ml）

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 見表2。

表2 保留時(shí)間和峰面積變異系數(shù)（%）

2.5 兩組小鼠肝組織腺苷酸含量比較 與正常組對(duì)照比較，急性中毒組ATP含量明顯下降（P＜0.05），AMP含量明顯升高（P＜0.05），兩組小鼠ADP含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2、表3。

圖2 急性中毒組小鼠肝組織ATP、ADP和AMP含量變化

表3 兩組小鼠肝組織腺苷酸含量比較（μg/g）

3 討論

ATP等能量物質(zhì)是研究疾病能量代謝變化的重要指標(biāo)[3]，屬于不穩(wěn)定化合物，且生物組織、血漿中存在降解ATP等的酶，為避免實(shí)驗(yàn)過(guò)程中能量物質(zhì)的降解，本研究采用低溫、加酸使酶失活，抽提ATP時(shí)要應(yīng)盡快將標(biāo)本移入預(yù)冷的高氯酸溶液中，在冰浴中迅速勻漿，使肝細(xì)胞破碎，充分提取細(xì)胞中的ATP，確保檢測(cè)結(jié)果真實(shí)反映肝組織能量代謝情況。本ATP提取方法是目前國(guó)內(nèi)外廣泛采用的技術(shù)，方法較成熟，具有簡(jiǎn)便、提取完全等優(yōu)點(diǎn)。

腺苷酸含量的測(cè)定以往多采用電泳、層析或酶學(xué)等分析方法，但這些方法操作復(fù)雜，靈敏度低，難以推廣應(yīng)用。目前檢測(cè)腺苷酸含量最常用的分析方法為高效液相色譜（HPLC）法[1-2，4]。筆者采用 RP-HPLC 法，與常規(guī)HPLC法相反，RP-HPLC是流動(dòng)相極性大于固定相極性的色譜。此方法改善了常規(guī)色譜中固定液流失分離效果差的缺點(diǎn)，除具備HPLC法的特點(diǎn)外，具有柱效高、靈敏度高、更敏捷等優(yōu)勢(shì)[5-7]。RP-HPLC法流動(dòng)相的種類和配比對(duì)分離效果影響很大，筆者采用乙腈磷酸緩沖液作流動(dòng)相，梯度洗脫，但每次運(yùn)行梯度洗脫后需重新平衡色譜柱，耗時(shí)較長(zhǎng)。本研究通過(guò)加大流速，改變梯度變化速率，縮短梯度時(shí)間等措施，使運(yùn)行時(shí)間明顯縮短，樣品主峰9min內(nèi)便獲得較好分離?；厥章?、精密度實(shí)驗(yàn)表明，該方法準(zhǔn)確性高、重復(fù)性較好。

本研究增加實(shí)驗(yàn)樣本量，通過(guò)RP-HPLC法測(cè)得急性溴苯腈中毒小鼠肝組織ATP含量明顯低于正常小鼠，AMP含量明顯升高，與文獻(xiàn)[8]報(bào)道一致，表明小鼠溴苯腈急性中毒可導(dǎo)致肝臟能量代謝障礙。此外，該技術(shù)方法在腦損傷疾病能量代謝研究中也有重要的應(yīng)用價(jià)值[9-11]。RP-HPLC法可快速、靈敏、準(zhǔn)確檢測(cè)不同能量代謝狀態(tài)下不同組織腺苷酸含量變化，是研究臨床疾病能量代謝變化的理想方法，在臨床中毒毒理研究[12-13]、生命科學(xué)等[14]領(lǐng)域均有一定的應(yīng)用價(jià)值。

[1]鄭屹,陳賽慧,葉薇,等.高效液相色譜法檢測(cè)細(xì)胞能量代謝物質(zhì)的方法建立與應(yīng)用[J].科技通報(bào),2012,28(7):46-50.

[2]朱會(huì)宇,吳丹妮,汪海林.高效液相色譜法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷及其代謝物的含量[J].色譜,2017,35(1):54-58.

[3]譚敬,朱宇麟,周榮勝,等.烏司他丁對(duì)肝大部切除合并缺血再灌注損傷后肝再生和能量代謝的影響[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2014,35(1):89-93.

[4]張美玲,張振南,溫從叢,等.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定人全血中滅多威[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志,2016,31(4):367-372.

[5]張巧真,宋偉明,吳柳松.反相高效液相色譜法測(cè)定人血中富馬酸喹硫平濃度及其在臨床藥學(xué)中的應(yīng)用[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志,2016,34(1):48-51.

[6]Roy C,Panigrahi L,Chakrabarty J.Validated Stability-Indicating RP-HPLC Method for the Estimation of Degradation Behaviour of Organic Peroxide and Third-Generation Synthetic Retinoids in Topical Pharmaceutical Dosage Formulation[J].Sci Pharm,2015,83(2):321-338.

[7]Alam A,Naik KK,Upadhaya NK,et al.Simple,efficient and economicalmethods forisolation and estimation ofnovel isoflavone using RP-HPLC[J].Methodsx,2017,23(4):128-133.

[8]Hu L,Hong G,Ma J,et al.Clearance rate and BP-ANN model in paraquatpoisoned patients treated with hemoperfusion[J].Biomed Research International,2015,2015:298253.

[9]吳彬,金露,王小同,等.慢性低氧高二氧化碳對(duì)小鼠大腦線粒體功能的影響[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,40(2):115-118.

[10]王志翊,盧中秋,邱俏檬,等.巰基化合物對(duì)溴苯腈中毒小鼠腦能量代謝影響[J].中國(guó)公共衛(wèi)生,2010,26(2):239-240.

[11]王志翊,盧中秋,邱俏檬,等.溴苯腈急性中毒小鼠腦組織能量代謝的改變[J].浙江醫(yī)學(xué),2009,31(2):173-175.

[12]李萌芳,陸長(zhǎng)軍,邱俏檬,等.二巰丙磺鈉對(duì)溴苯腈急性中毒小鼠中樞神經(jīng)毒性作用的干預(yù)[J].中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志,2010,28(10):752-755.

[13]Yilmaz I,Kaya E,Sinirlioglu ZA,et al.Clinical importance of toxin concentration in Amanita verna mushroom[J].Toxicon,2014,87:68-75.

[14]Wu JL,Yu SY,Wu SH,et al.A sensitiveand practical RP-HPLC-FLD for determination of the low neuroactive amino acid levels in body fluids and its application in depression[J].Neurosci Lett,2016,616:32-37.