高健磊， 李 超， 閆怡新， 丁靜雨

(鄭州大學水利與環(huán)境學院，鄭州 450001)

隨著城鎮(zhèn)化的快速建設，污水處理量的日益增長，剩余污泥的產量也在快速增加。依據(jù)2016年行業(yè)統(tǒng)計數(shù)據(jù)，我國污泥年產量已高達7 000萬t(含水率80%)[1]。隨著我國“水十條”的出臺，對剩余污泥減量化、無害化及資源化利用已經(jīng)成為當務之急。剩余污泥主要由細菌、原生動物、后生動物、藻類和懸浮物等物質組成[2-3]，其中蛋白質含量約占30%～60%[4]。污泥中的蛋白質可用于制備蛋白飼料、有機肥、可生物降解的發(fā)泡劑、泡沫滅火劑及泡沫混凝土保溫材料等[5～7]，這樣既利于環(huán)境保護，也為污泥的處理處置開辟了一條新的資源化途徑。

剩余污泥中的大多數(shù)蛋白質存在于微生物細胞內部，其提取原理就是使其從微生物細胞內被釋放出來進入液相的過程。目前污泥中蛋白質的提取主要采用堿熱法[8～10]，并且已經(jīng)實現(xiàn)了局部工業(yè)化應用[11]。堿熱法的蛋白提取率可達60%以上，但是往往需要120℃以上的高溫和pH>12的堿性環(huán)境[9]，對設備和管理要求較高，不利于后續(xù)蛋白質的提純利用。酶法水解提取蛋白在農業(yè)、食品等領域已有廣泛應用[12～14]，在污泥水解提取蛋白方面也有一些報道。其主要應用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶[15-16]等對污泥中的蛋白質進行提取，其溫度多在40℃～55℃，具有操作簡單、反應條件溫和、無二次污染等特點[15～17]。但是相較堿熱法而言，其蛋白提取率較低。

本研究采用中性蛋白酶對污泥蛋白進行提取，并在酶解反應前增加了超聲波預處理，從蛋白提取率和酶解后污泥的脫水性能兩個方面研究了超聲波對污泥酶解的強化效果，并采用響應曲面法[18]對超聲波強化污泥酶法提取蛋白質工藝進行了優(yōu)化，為該技術的進一步開發(fā)應用提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑

試驗所用剩余污泥取自鄭州市某城鎮(zhèn)污水處理廠重力濃縮池，原泥平均含水率為99%，性質如表1所示。原污泥經(jīng)離心后調節(jié)其含固率為4%進行試驗。

表1 原泥的性質Tab.1 Properties of the original sludge

試驗采用北京奧博星生物技術有限公司提供的中性蛋白酶，基本參數(shù)如表2所示。試驗用其他試劑均為分析純。

表2 中性蛋白酶的基本參數(shù)Tab.2 Parameters of the neutral protease

1.2 試驗方法

試驗采用探頭式超聲波細胞破碎機(JY92-11N，寧波新芝生物科技股份有限公司)對污泥進行超聲處理，輸出頻率25kHz。試驗過程中，將200mL污泥放置于250mL燒杯中，探頭垂直伸入污泥液面下1cm。根據(jù)前期的實驗結果，設置功率密度為1.75W/mL，超聲時間20min，占空比50%。

在酶解實驗中，將經(jīng)超聲預處理后的200mL污泥置于500mL錐形瓶中，首先用NaOH或HCl調節(jié)pH值，并加入中性蛋白酶，然后置于預設好溫度的恒溫振蕩水浴鍋(SHZ-82A，金壇市富華儀器有限公司)中進行酶解反應；反應結束后在100℃水浴條件下滅活15min，接著于4 000rmp下離心30min，得到蛋白提取液。

試驗中，另取沒有經(jīng)過超聲預處理的污泥在相同條件下進行酶解作為對照。

1.2.1 單因素試驗

在酶解試驗過程中，預設pH=7.4、酶加量3 000U/g(干泥，下同)、酶解溫度45℃，酶解時間4h為工藝流程中的常規(guī)量，以pH(6.5、7.0、7.4、7.8、8.5)、酶加量(1 000U/g、2 000 U/g、3 000 U/g、4 000U/g、5 000 U/g、6 000 U/g)、酶解溫度(35℃、40℃、45℃、50℃、55℃)、酶解時間(2h、3h、4h、5h、6h)等4個單因素變量替換工藝流程中相應的常規(guī)量對污泥蛋白進行提取，研究蛋白提取率和污泥比阻的變化。

1.2.2 響應面法優(yōu)化試驗設計

根據(jù)單因素實驗的結果，選擇顯著影響蛋白提取率的3個因素，使用Design-Expert8.0.6軟件進行三因素三水平試驗設計，建立數(shù)學回歸模型并分析。

1.3 測試及計算方法

pH的測定使用pH計(PHSJ-4A型，上海精密科學儀器有限公司)；蛋白質的測定采用凱氏定氮法[19]；SCOD采用文獻[19]的方法；污泥比阻采用文獻[20]的方法。實驗過程中，每個試樣進行3次平行，結果取其平均值。

蛋白提取率(Rp)的計算如式(1)：

(1)

式中：m1、m2—分別為蛋白提取液和原污泥中蛋白質含量，mg。

污泥脫水性能提高率(Dw)的計算公式如式(2)：

(2)

式中：S0、S1—分別為處理前后的污泥比阻，S2/g。

圖1 pH對酶解污泥提取蛋白質和污泥脫水性能的影響Fig.1 Effects of pH on extraction of protein and sludge dewatering

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 pH對污泥酶解提取蛋白質的影響

如圖1A所示，不管是否經(jīng)過超聲預處理，蛋白提取率隨著酶解pH的增加而呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在pH 7.4附近達到了最大值。pH是影響酶活性的一個重要因素，在適合的pH條件下，酶活性中心某些電離狀態(tài)的氨基酸殘基與底物的結合處于最適狀態(tài)，進而以最優(yōu)活性參與反應[21]。因此，可以認為pH 7.4為中性蛋白酶作用的最適pH值。另外，我們通過比較超聲預處理和未超聲處理的污泥的酶解污泥蛋白提取結果可以看出，超聲預處理后的污泥酶解蛋白提取率可提高40%左右。超聲波具有獨特的空化作用[22～24]，它可以使污泥發(fā)生破解，在后續(xù)的酶解過程中，增大了酶與底物的接觸面積，進而增加了水解度，使蛋白質提取率增加。

污泥脫水性能是在污泥資源化處理中不可忽視的因素。從圖1(B)中可以看出，隨著酶解pH的增加，污泥脫水性能與蛋白質提取率有著相似的變化趨勢，即在pH 7.4時達到最大值，隨后緩慢下降。同樣地，超聲波預處理也可以有效地提高酶解污泥的脫水性能，其污泥脫水性能最大可提高80%以上，大大減輕了后續(xù)污泥處置的負荷。

2.1.2 酶加量對污泥酶解提取蛋白質的影響

圖2 酶加量對酶解污泥提取蛋白質和污泥脫水性能的影響Fig.2 Effects of enzyme dosage on extraction of protein and sludge dewatering

如圖2(A)所示，隨著酶加量的增加，蛋白提取率逐漸增加，但是當酶加量達到4 000U/g以后時，蛋白提取率基本不再發(fā)生變化。當?shù)孜餄舛纫欢〞r，隨著酶加量的增加，底物與酶的接觸逐漸增大，當達到飽和后，酶無法與底物的結合，因此對蛋白質的提取率貢獻并不大，且會造成酶使用的浪費。從圖2(A)中還可以看出，經(jīng)超聲預處理后，在4 000U/g的酶加量條件下其蛋白質提取率可較單獨酶解提高38%左右；另外，經(jīng)過超聲預處理后，當酶加量為2 000U/g時，其蛋白質提取率已經(jīng)可以達到單獨酶解在3 000U/g的蛋白提取水平，超聲波的引入可以有效降低酶的使用量。圖2(B)中的污泥脫水性能也呈現(xiàn)類似的趨勢，在酶加量4 000U/g條件下污泥脫水性能提高最為顯著。因此確定最佳酶加量為4 000U/g。

圖3 酶解時間對污泥提取蛋白質和污泥脫水性能的影響Fig.3 Effects of enzymolysis time on extraction of protein and sludge dewatering

2.1.3 酶解時間對污泥酶解提取蛋白質的影響

如圖3(A)所示，圖中蛋白提取率隨酶解時間的延長而增加，在4h以后趨于平緩。酶解反應中，剛開始酶的底物比較充足，水解反應速度較快；當酶解時間繼續(xù)延長，底物不斷減少；直至酶解反應結束時，即使酶解時間繼續(xù)延長蛋白提取率也不會繼續(xù)增加，甚至可能由于酶解時間的延長，其他因素對蛋白質造成了破壞。污泥脫水性能(圖3B)與蛋白質提取率的變化曲線類似，所以認為最適的污泥酶解時間為4.0h。從圖3(A)中還可以看出，經(jīng)超聲波預處理后，2h內的蛋白提取率就大于單獨酶解的提取效果，說明超聲波大大加速了酶解反應的速度，提高了酶解效率。

2.1.4 溫度對酶催化污泥水解提取蛋白質的影響

圖4 酶解溫度對污泥提取蛋白質和污泥脫水性能的影響Fig.4 Effects ofenzymolysis temperature on extraction of protein and sludge dewatering

如圖4(A)所示，蛋白提取率隨著酶解溫度的增加，呈現(xiàn)出上升趨勢；在溫度為50℃時，蛋白提取率達到最高值，隨著溫度的進一步增加，蛋白提取率逐漸下降。超聲強化酶解以及單獨酶解顯示了同樣的趨勢，說明超聲波預處理并未改變酶催化污泥水解的適宜溫度。隨著溫度的升高，促使反應向正反應方向進行。但是，超過一定溫度將導致酶失活。因此，可以認為在水解提取污泥蛋白過程中中性蛋白酶的最適溫度是50℃，這與中性蛋白酶的最適溫度40℃有一定的偏差。這可能是因為在較高的溫度下有利于污泥的熱解，從而使污泥絮體部分破壞，增加了酶和底物的接觸機會。因此，在污泥酶解過程中，較高的溫度是有利的。但是過高的溫度會導致酶失活，因此，實際應用中應謹慎選擇。另外，從污泥脫水性能來看，較高的溫度促進了污泥的水解，其污泥脫水性能顯著提高。從圖4(B)中單獨酶的污泥脫水性能曲線來看，熱解對于污泥脫水性能的影響甚至超過了酶解。

2.2 響應曲面法優(yōu)化蛋白質提取工藝

2.2.1 響應面試驗及其結果分析

根據(jù)單因素試驗結果，對超聲波預處理后的污泥酶解提取蛋白質進行響應面優(yōu)化試驗，以蛋白提取率(%)為響應值Y，其因素水平及編碼見表1，實驗結果見表2和表3。

表1 響應面分析因素與水平Tab.1 Factors and levels of response surface methodology

表2 響應面試驗設計及結果Tab.2 Design and results of response surface methodology

表3 響應面結果方差分析表Tab.3 Variance analysis ofresponse surface methodology

2.2.2 響應曲面圖及其分析

應用design-Expert 8.0.6軟件對實驗數(shù)據(jù)分析，獲得因素交互的響應曲面圖(圖5、圖6)，由響應曲面得到最佳工藝條件為：酶加量4 500U/g、酶解時間4h、溫度48℃，此時蛋白提取率為36.2%。采用上述工藝重復3次試驗測得蛋白提取率為35.9%。實際值測定值與理論測定值基本吻合。表明響應曲面優(yōu)化工藝參數(shù)是可靠的。

圖5 溫度與酶加量交互作用對污泥蛋白提取率影響的等高線圖和響應面圖Fig.5 Response surface graph and contour map for effect of temperature and enzyme dosage on extraction ratioof protein

從圖5的等高線圖可以看出，沿酶加量軸向等高線密集，而溫度軸向等高線相對稀疏，說明酶加量對蛋白提取率的影響比溫度大。等高線呈橢圓形，說明兩種因素的交互作用較顯著。從圖5的響應面圖可以看出，酶加量對提取污泥蛋白的影響較為顯著，曲面較陡，隨著酶加量的增大，蛋白質的提取率先增大而后趨于平緩。溫度對提取污泥蛋白的影響主要表現(xiàn)在為酶提供一個適宜的作用環(huán)境。從圖中看出溫度在上升過程中出現(xiàn)一個頂點。此時為酶的適宜溫度，助于酶發(fā)揮催化作用。

圖6 時間與溫度交互作用對污泥蛋白提取率影響的等高線圖和響應面圖Fig.6 Response surface graph and contour map for effect of time and temperature on extraction ratio of protein

從圖6的等高線圖可以看出，沿溫度軸向等高線密集，說明溫度對提取蛋白的影響比時間大。等高線呈橢圓形，說明兩種因素的交互作用較顯著。從圖6的響應面圖可以看出，溫度對污泥蛋白提取率的影響較為顯著，曲面較陡，隨著溫度的增大，蛋白質的提取率先增大而后下降。時間對提取蛋白的影響相對說沒有溫度明顯。隨著反應時間的延長，蛋白質的提取率先增大而后趨于平緩。說明反應進行一定時間后底物被消耗殆盡，時間的延長蛋白質的提取率不再顯著增加。

3 結 論

本試驗采用超聲波預處理對中性蛋白酶水解污泥提取蛋白質的強化效果進行了研究，結果表明，超聲預處理后，污泥蛋白提取率可增加40%左右，污泥脫水性能可提高80%以上；采用響應面曲線法優(yōu)化了酶解蛋白提取工藝，得出污泥蛋白經(jīng)超聲預處理酶解提取的最佳工藝條件為：酶加量4 500U/g、酶解溫度48℃、酶解時間4h。在最優(yōu)條件下進行驗證，蛋白提取率為35.9%，與理論值36.2%基本一致。

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