何 晶，馮成天，郭秀麗，胡義鈺，孫 亮，王真輝，袁 坤*

(1.海南大學(xué) 熱帶農(nóng)林學(xué)院，海南 海口 570100；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 橡膠研究所，農(nóng)業(yè)部橡膠樹(shù)生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737)

橡膠樹(shù)是重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，由其產(chǎn)生的天然橡膠是一種戰(zhàn)略物資，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)和國(guó)防建設(shè)中發(fā)揮著巨大作用。天然橡膠主要是來(lái)源于巴西橡膠樹(shù)(HeveabrasiliensisMuell.Arg.)乳管細(xì)胞中的膠乳。橡膠樹(shù)死皮(Tapping Panel Dryness,TPD，即割面干涸)，是指乳管細(xì)胞喪失部分或全部產(chǎn)膠能力的現(xiàn)象，其癥狀為割線排膠減少甚至是完全停止排膠[1]，嚴(yán)重影響膠乳產(chǎn)量[2-3]，其發(fā)生的生理與分子機(jī)制是我國(guó)天然橡膠生產(chǎn)急需解決的重要問(wèn)題。研究死皮發(fā)生動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中膠乳生理參數(shù)的變化，對(duì)橡膠樹(shù)死皮發(fā)生機(jī)理的闡明具有一定的指導(dǎo)意義。

乙烯利廣泛應(yīng)用于天然橡膠割膠生產(chǎn)，具有增產(chǎn)的效果，但隨著乙烯利的過(guò)度使用，其副作用也日益體現(xiàn)，主要表現(xiàn)為排膠線內(nèi)縮、樹(shù)皮肥腫和死皮等[4]。有研究認(rèn)為，橡膠樹(shù)死皮發(fā)生后，膠乳黃色體穩(wěn)定性下降，黃色體破裂指數(shù)增加[5]，死皮樹(shù)中膠乳的硫醇含量明顯下降，其作為自由基清除劑不能有效地清除有毒氧對(duì)黃色體膜的危害，所以導(dǎo)致黃色體膜受損，乳管停止排膠而逐漸死皮[6]。Putranto[7]等的研究表明，與正常樹(shù)相比，死皮樹(shù)膠乳中蔗糖、硫醇和無(wú)機(jī)磷含量均下降，暗示了死皮樹(shù)乳管產(chǎn)膠能力下降。郭秀麗[8]等對(duì)橡膠樹(shù)不同死皮程度植株的膠乳生理參數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，膠乳產(chǎn)量、硫醇和無(wú)機(jī)磷含量等隨死皮程度的增加而降低，而蔗糖、鎂離子含量及黃色體破裂指數(shù)等隨死皮程度的增加而增加。

現(xiàn)有關(guān)于橡膠樹(shù)死皮發(fā)生的生理基礎(chǔ)的研究，主要是在膠園中直接選取健康樹(shù)和死皮樹(shù)進(jìn)行比較分析，這種研究很難反映死皮發(fā)生的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中生理指標(biāo)的變化。本研究采用高濃度乙烯利刺激的方法，逐步誘導(dǎo)橡膠樹(shù)死皮的發(fā)生：乙烯利刺激過(guò)程中，健康樹(shù)割線癥狀由排膠線正常，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榕拍z線內(nèi)縮(指割膠后排膠線比正常情況下明顯變窄的現(xiàn)象，簡(jiǎn)稱“內(nèi)縮”)、嚴(yán)重內(nèi)縮(指割膠后在割線上只能看到緊挨割面處有一條很窄的排膠線)[9]，直至割線部分不排膠，即發(fā)生死皮。研究死皮發(fā)生動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中植株膠乳各生理參數(shù)的變化，從而為闡明橡膠樹(shù)死皮發(fā)生機(jī)理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來(lái)源于海南省儋州市西慶民營(yíng)膠園，品系為橡膠樹(shù)無(wú)性系熱研7-33-97，2006年定植，2015年開(kāi)割，采用s/2 d/3割制(割線長(zhǎng)度為樹(shù)圍的1/2，每3 d割1刀)。試驗(yàn)前，該林段每年施用2次橡膠樹(shù)專用復(fù)合肥，主要包括有機(jī)質(zhì)、氮、磷、鉀等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)材料的選擇與處理 選擇樹(shù)圍大小相對(duì)一致、樹(shù)皮完好、割面排膠正常的健康橡膠樹(shù)作為試驗(yàn)材料。 2016年9-11月，用5%乙烯利濃度[10](一般生產(chǎn)上使用的乙烯利濃度為0.5%～1%，隨著割齡增加，乙烯利濃度會(huì)適當(dāng)增加，但一般不超過(guò)3%，而且涂乙烯利的周期一般是2次/月，涂施濃度太大或頻率提高，都會(huì)對(duì)橡膠樹(shù)造成傷害，導(dǎo)致死皮的發(fā)生)刺激所選取的健康樹(shù)來(lái)誘導(dǎo)死皮的發(fā)生，即每10 d沿割線在割面2 cm寬處均勻涂刷乙烯利1次，共涂刷7次。健康樹(shù)作為對(duì)照，健康樹(shù)經(jīng)5%乙烯利處理1個(gè)半月后產(chǎn)生割線內(nèi)縮癥狀、2個(gè)月后產(chǎn)生嚴(yán)重內(nèi)縮癥狀，2個(gè)半月后產(chǎn)生部分不排膠(死皮)癥狀。每種癥狀選取9株樹(shù)，分成3組，每組3株樹(shù)作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，即每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。取割膠后5～25 min排出的膠乳，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)3株樹(shù)各取10 mL膠乳等量混合，置于冰上后迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行膠乳各生理參數(shù)的測(cè)定。

1.2.2 膠乳生理參數(shù)測(cè)定 膠乳產(chǎn)量、干膠含量及pH值的測(cè)定參照郭秀麗[8]等的方法進(jìn)行；膠乳硫醇含量參考魏芳[11]等的DTNB試劑法進(jìn)行測(cè)定；無(wú)機(jī)磷含量的測(cè)定采用鉬酸銨比色法進(jìn)行[12]；蔗糖含量的測(cè)定采用蒽銅試劑法進(jìn)行[13]；粗酶液蛋白質(zhì)含量及黃色體破裂指數(shù)分別參照袁坤[2]等、程成[14]等的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Excel 2007、SAS 9.0以及Origin Pro 2015軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理、統(tǒng)計(jì)分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙烯利刺激誘導(dǎo)死皮發(fā)生過(guò)程中膠乳產(chǎn)量和干膠含量的變化

乙烯利刺激誘導(dǎo)橡膠樹(shù)死皮發(fā)生的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中，健康樹(shù)割線癥狀由排膠線正常逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)縮、嚴(yán)重內(nèi)縮，直至部分死皮的發(fā)生。在這一動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中，平均單株膠乳產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。未涂乙烯利之前，即健康樹(shù)(對(duì)照)的膠乳產(chǎn)量為97.50 mL，涂高濃度乙烯利后割線出現(xiàn)內(nèi)縮癥狀時(shí)，膠乳產(chǎn)量顯著提高(P<0.05,下同)，達(dá)最大值228.20 mL，是對(duì)照的2倍多。隨著乙烯利刺激時(shí)間的增加，當(dāng)割線出現(xiàn)嚴(yán)重內(nèi)縮時(shí)，膠乳產(chǎn)量顯著下降至86.60 mL。當(dāng)出現(xiàn)部分死皮時(shí)，產(chǎn)量顯著下降至最低值30.20 mL，約為對(duì)照健康樹(shù)膠乳產(chǎn)量的31%(圖1)。

注：圖柱上方不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

圖1乙烯利刺激誘導(dǎo)死皮發(fā)生過(guò)程中膠乳產(chǎn)量的變化

Fig.1 The change of latex yield during TPD occurrence induced by ethrel stimulation

干膠含量的變化趨勢(shì)與膠乳產(chǎn)量的變化趨勢(shì)基本一致，也呈先上升后下降的趨勢(shì)。健康樹(shù)的干膠含量為23.59 %，內(nèi)縮癥狀時(shí)植株干膠含量顯著上升至最大值39.09 %，隨后干膠含量顯著下降，發(fā)生部分死皮植株的干膠含量降至最低值22.11 %(圖2)。

2.2 乙烯利刺激誘導(dǎo)死皮發(fā)生過(guò)程中膠乳各生理參數(shù)的變化

乙烯利刺激后，膠乳硫醇、無(wú)機(jī)磷及蔗糖含量均發(fā)生顯著變化，同未刺激前植株相比，差異均達(dá)顯著水平，且三者變化趨勢(shì)一致，均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。乙烯利刺激前，膠乳硫醇、無(wú)機(jī)磷和蔗糖含量最低，分別為0.48、4.11 mmol/L和11.79 mmol/L；刺激后割線出現(xiàn)內(nèi)縮癥狀時(shí)，膠乳硫醇、無(wú)機(jī)磷和蔗糖含量顯著提高，達(dá)到最高值，分別為1.56、 32.76 mmol/L和58.10 mmol/L，約為對(duì)照的3倍多、8倍和4倍；隨后膠乳硫醇、無(wú)機(jī)磷和蔗糖含量又顯著下降，部分死皮時(shí)，三者分別為0.66、23.28 mmol/L和25.41 mmol/L。不同癥狀之間膠乳硫醇、無(wú)機(jī)磷和蔗糖含量均達(dá)顯著性差異。

圖2 乙烯利刺激誘導(dǎo)死皮發(fā)生過(guò)程中干膠含量的變化

圖3 乙烯利刺激誘導(dǎo)死皮發(fā)生過(guò)程中硫醇含量的變化

乙烯利刺激前后膠乳pH值和粗酶液蛋白含量也均呈先上升后下降的趨勢(shì)。嚴(yán)重內(nèi)縮癥狀出現(xiàn)之前，健康及內(nèi)縮植株間膠乳pH值無(wú)明顯差異，內(nèi)縮時(shí)膠乳pH值最高，為7.06。隨后pH值下降，部分死皮出現(xiàn)后，膠乳pH值顯著下降至最低值6.49；而粗酶液蛋白含量在植株割線癥狀由正常向嚴(yán)重內(nèi)縮變化的過(guò)程中，呈顯著上升趨勢(shì)，嚴(yán)重內(nèi)縮時(shí)上升至最大值15.85 mg/L，隨后顯著下降，部分死皮出現(xiàn)時(shí)降至最低值15.22 mg/L。

值得注意的是，乙烯利刺激后，黃色體破裂指數(shù)的變化趨勢(shì)與上述各生理指標(biāo)變化趨勢(shì)不同，呈先下降后顯著上升的趨勢(shì)。健康植株黃色體破裂指數(shù)為18.72%，當(dāng)割線出現(xiàn)內(nèi)縮時(shí)，黃色體破裂指數(shù)顯著下降，達(dá)最低值14.27%。隨后又顯著上升，出現(xiàn)嚴(yán)重內(nèi)縮時(shí)，破裂指數(shù)上升至19.15%，當(dāng)部分死皮出現(xiàn)后，破裂指數(shù)顯著增加到最高值33.69%，約為健康植株的1.8倍。

圖4 乙烯利刺激誘導(dǎo)死皮發(fā)生過(guò)程中無(wú)機(jī)磷含量的變化

圖5 乙烯利刺激誘導(dǎo)死皮發(fā)生過(guò)程中蔗糖含量的變化

圖6 乙烯利刺激誘導(dǎo)死皮發(fā)生過(guò)程中pH值的變化

3 結(jié)論與討論

采用乙烯利刺激已成為提高橡膠樹(shù)產(chǎn)量的重要手段，并在天然橡膠生產(chǎn)中大面積推廣應(yīng)用[15-16]，涂施乙烯利可促使橡膠樹(shù)膠乳產(chǎn)量增加1.5～2倍[17]。但是過(guò)度的乙烯利刺激會(huì)導(dǎo)致橡膠樹(shù)死皮的發(fā)生。乙烯利過(guò)度刺激誘導(dǎo)橡膠樹(shù)死皮的組織學(xué)、生物化學(xué)等方面前人已開(kāi)展過(guò)一些研究[4,18-20]，但關(guān)于生理方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

圖7 乙烯利刺激誘導(dǎo)死皮發(fā)生過(guò)程中粗酶液蛋白含量的變化

圖8 乙烯利刺激誘導(dǎo)死皮發(fā)生過(guò)程中黃色體破裂指數(shù)的變化

本研究結(jié)果表明，高濃度乙烯利刺激后，割線由正常排膠逐漸發(fā)展為排膠線內(nèi)縮、嚴(yán)重內(nèi)縮，最后部分割線不排膠，即死皮發(fā)生。吳繼林[4]等通過(guò)對(duì)過(guò)度乙烯利刺激后割線樹(shù)皮結(jié)構(gòu)變化的研究中發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)間過(guò)度刺激采膠導(dǎo)致失去排膠功能的乳管列從樹(shù)皮外層逐漸擴(kuò)展到樹(shù)皮內(nèi)層，直至死皮的發(fā)生，這與本研究的觀測(cè)結(jié)果一致。

膠乳產(chǎn)量和干膠含量反映了膠乳的合成和再生能力，而黃色體破裂指數(shù)則反映了膠乳中黃色體的穩(wěn)定性、完整性。破裂指數(shù)愈大，膠乳愈不穩(wěn)定，愈容易凝固堵塞，使膠乳停排[5,14]。本研究結(jié)果顯示，高濃度的乙烯利刺激誘導(dǎo)橡膠樹(shù)死皮發(fā)生的過(guò)程中，膠乳產(chǎn)量和干膠含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在刺激的早期出現(xiàn)割線內(nèi)縮癥狀時(shí)，膠乳產(chǎn)量和干膠含量均達(dá)最大值，而此時(shí)黃色體破裂指數(shù)最低。表明刺激早期，乙烯利刺激可能通過(guò)提高黃色體的穩(wěn)定性來(lái)延長(zhǎng)排膠時(shí)間，進(jìn)而增加膠乳產(chǎn)量，這與目前認(rèn)為的乙烯利刺激增產(chǎn)的機(jī)制是一致的[15,21]。隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，膠乳產(chǎn)量和干膠含量明顯下降，當(dāng)出現(xiàn)部分死皮時(shí)，二者均降至最低值，而此時(shí)黃色體破裂指數(shù)達(dá)最大值，這說(shuō)明乙烯利的過(guò)度刺激導(dǎo)致黃色體的穩(wěn)定性受到破壞，黃色體破裂后釋放出凝固因子，膠乳原位凝固致使排膠受阻而死皮發(fā)生[21]。吳繼林[4]等的組織學(xué)研究結(jié)果也顯示，過(guò)度刺激后樹(shù)皮乳管內(nèi)的黃色體破裂并與橡膠粒子一起形成絮狀物，這進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究的結(jié)果。上述研究結(jié)果說(shuō)明，黃色體在高濃度乙烯利刺激誘導(dǎo)橡膠樹(shù)死皮發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

本研究的結(jié)果可以看出，乙烯利刺激誘導(dǎo)死皮發(fā)生過(guò)程中，除黃色體破裂指數(shù)外，其余各生理參數(shù)的變化趨勢(shì)均呈先上升后下降的趨勢(shì)。硫醇是乳管細(xì)胞中重要的還原劑，具有清除乳管細(xì)胞代謝過(guò)程中所產(chǎn)生的有毒氧的功能，從而減少有毒氧對(duì)乳管細(xì)胞的傷害[11,22]。?，F(xiàn)周和蔡磊[20]等的研究顯示，高濃度的乙烯利刺激可提高乳管細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生速率和含量。據(jù)此推測(cè)，在本研究中高濃度的乙烯利刺激誘導(dǎo)橡膠樹(shù)死皮發(fā)生過(guò)程中，活性氧含量可能也是逐漸增加的。在刺激早期出現(xiàn)內(nèi)縮癥狀時(shí)，硫醇含量達(dá)最大值，暗示此時(shí)硫醇對(duì)活性氧的清除能力較強(qiáng)。隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，硫醇含量逐漸降低至出現(xiàn)部分死皮，說(shuō)明隨著活性氧的大量產(chǎn)生，硫醇對(duì)活性氧的清除能力逐漸下降，導(dǎo)致有毒氧的過(guò)多積累對(duì)乳管細(xì)胞造成傷害，進(jìn)而可能導(dǎo)致死皮的發(fā)生。

無(wú)機(jī)磷是反映乳管能量代謝的重要指標(biāo)。膠乳中無(wú)機(jī)磷含量高，說(shuō)明乳管能量代謝活躍[23]。本研究結(jié)果顯示，乙烯利刺激誘導(dǎo)死皮發(fā)生過(guò)程中，乳管系統(tǒng)代謝能力先增強(qiáng)后逐漸減弱。

蔗糖是橡膠生物合成的原料，其含量是綜合反映乳管蔗糖供給和利用效率的指標(biāo)[24]。本研究結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)死皮發(fā)生過(guò)程中，蔗糖含量先升高隨后降低，說(shuō)明乙烯利刺激后的早期剛出現(xiàn)內(nèi)縮癥狀時(shí)，蔗糖含量顯著上升，即用于合成橡膠的前體充足，膠乳的合成和再生能力較強(qiáng)，因此膠乳產(chǎn)量很高。隨著嚴(yán)重內(nèi)縮及部分死皮的出現(xiàn)，蔗糖含量逐漸下降，進(jìn)而導(dǎo)致膠乳產(chǎn)量的降低。此外，膠乳pH值與膠乳再生相關(guān)[25]，而粗酶液蛋白含量與乳管系統(tǒng)合成代謝相關(guān)[26]，二者在乙烯利刺激誘導(dǎo)死皮發(fā)生過(guò)程中也發(fā)生顯著變化，表明它們與橡膠樹(shù)死皮發(fā)生也是緊密相關(guān)的。

橡膠樹(shù)死皮發(fā)生是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程。本研究利用高濃度乙烯利刺激誘導(dǎo)橡膠樹(shù)死皮的發(fā)生，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)了死皮發(fā)生過(guò)程中膠乳各生理指標(biāo)的變化，為后續(xù)進(jìn)一步開(kāi)展死皮發(fā)生動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中相關(guān)基因或蛋白的表達(dá)變化奠定了基礎(chǔ)，也為闡明橡膠樹(shù)死皮發(fā)生機(jī)理提供一定的理論依據(jù)。

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