朱日明 羅瑜

三草鼻咽清煎膏劑全方由黃芪、魚腥草、 夏枯草、龍膽等十一味中藥組成, 具有清熱解毒、散結(jié)消炎的功效, 主要用于鼻咽部鼻咽部慢性炎癥疾病。為了有效地控制制劑的內(nèi)在質(zhì)量, 本研究選擇方中黃芪的活性成分黃芪甲苷作為質(zhì)控指標(biāo)［1］, 采用HPLC-ELSD法對其含量進行方法學(xué)分析研究,現(xiàn)將實驗結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Agilent1200高效液相色譜儀(配有G1312A二元泵、蒸發(fā)光散射檢測器和安捷倫色譜工作站)；色譜柱Eclipse XDB-C18柱 (200 mm×4.6 mm, 5 μm)；YP202N 型電子天平(上海精密儀器有限公司)。

黃芪甲苷對照品(購自中國食品藥品檢定研究院, 供含量測定用)；三草鼻咽清煎膏劑 (韶關(guān)市中醫(yī)院制劑室自制 , 批號 ：20170228, 20170414, 20170605, 20170810, 規(guī)格 ：100 g/瓶)；陰性樣品(按處方比例, 除去被檢藥材同法制備而成);乙腈(色譜純)；水為重蒸餾水；其他試劑均為分析純。

1.2 溶液制備 精密稱取黃芪甲苷對照品適量, 加甲醇配制成約0.1 g/L的溶液, 作為對照品溶液；精密量取三草鼻咽清煎膏劑50 ml, 轉(zhuǎn)移至分液漏斗中, 用水飽和的正丁醇提取4 次 (30 、30 、25 、25 ml), 合并正丁醇液 , 用氨試液洗滌 2 次 ,40 ml/次, 正丁醇液回收溶劑至干, 殘渣加甲醇溶解, 并移至5 ml量瓶中, 用甲醇稀釋至刻度, 搖勻, 用0.45 μm微孔濾膜濾過, 取續(xù)濾液作為供試品溶液；取按處方比例及制備工藝制備不含黃芪的陰性樣品, 按照供試品溶液的制備方法制成陰性對照品溶液。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Eclipse XDB-C18柱(200 mm×4.6 mm, 5 μm)；柱溫 ：25 ℃ ；流動相 ：乙腈 -水 32∶68)；流速：1.0 ml/min；ELSD參數(shù)：漂移管溫度：60 ℃；載氣流速：1.6 ml/min。

1.3.2 色譜系統(tǒng)適用性試驗 按“1.3.1”項下色譜條件,將對照品溶液、供試品溶液、陰性對照液各10 μl注入高效液相色譜儀, 測定, 并記錄色譜圖。

2 結(jié)果

供試品溶液中黃芪甲苷能與其他成分有較好的分離度,陰性對照液無干擾峰出現(xiàn)。色譜圖見圖1～3。

圖1 供試品HPLC圖

圖2 黃芪甲苷對照品HPLC圖

圖3 陰性樣品HPLC圖

2.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述對照品溶液1、5、10、15、20 μL, 按擬定的色譜條件, 分別注入液相色譜儀, 記錄色譜圖、峰面積值。以峰面積的自然對數(shù)值為縱坐標(biāo)(Y), 以濃度的自然對數(shù)值為橫坐標(biāo)(X), 得回歸方程：Y=1.7733X+1.8092(R2=0.9990), 結(jié)果表明黃芪甲苷在0.5781～11.5614 g/L范圍內(nèi)峰面積與濃度之間呈良好的線性關(guān)系。

2.2 精密度試驗 取同一份對照品溶液, 連續(xù)進樣6次,15 μl/次, 記錄黃芪甲苷峰面積, 結(jié)果RSD=0.55%。

2.3 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試液, 分別于0、2、4、6、8、24 h進樣, 記錄黃芪甲苷色譜圖的峰面積的RSD為0.19%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.4 重復(fù)性試驗 取同一批樣品(批號為20170228)按“1.2”項下的方法制備6份供試液, 分別進樣測定, 以黃芪甲苷的峰面積計算RSD為0.54%, 表明本品含量測定方法重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的批號為20170228的樣品(黃芪甲苷含量為0.0362 mg/ml)30 ml, 平行取樣9份, 分別在1～3號樣品中精密加入黃芪甲苷對照品溶液1.8 ml, 在4～6號樣品中精密加入黃芪甲苷對照品溶液2.1 ml, 在7～9號樣品中精密加入黃芪甲苷對照品溶液2.6 ml,按“1.2”項下的方法制備供試液, 按上述色譜條件測定, 計算回收率, 結(jié)果平均回收率為99.37%, RSD=0.44%。表明該方法符合定量分析的要求。見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.6 樣品的含量測定 取3批樣品(批號分別為20170414、20170605、20170810), 按“1.2”項下的方法制備成供試品溶液, 依方法進樣10 μl測定含量。見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 本文在制備三草鼻咽清煎膏劑中黃芪甲苷的供試液時,主要參考了參照2015年版《中國藥典(一部)》及相關(guān)文獻［2-4］, 同時進行了黃芪甲苷不同的提取實驗, 而從本院制劑室實際檢驗條件, 考慮成本, 操作方法, 因此本實驗制備供試液采用水飽和的正丁醇提取、氨試液洗滌的方法, 確保次數(shù)及每次試劑用量, 經(jīng)反復(fù)驗證, 黃芪甲苷提取率較高,既縮短了樣品前處理的時間, 而且樣液的穩(wěn)定性較好。

3.2 本文在參考關(guān)于黃芪甲苷含量測定相關(guān)文獻報道的基礎(chǔ)上［5-7］, 進行了色譜系統(tǒng)的優(yōu)化實驗?？疾炝肆鲃酉嘁译?水的比例、色譜分離效果, 實驗結(jié)果以乙腈-水(32∶68)為流動相時, 黃芪甲苷色譜峰與其他峰能達到較好的基線分離,且出峰時間合適［8-14］。

3.3 本文以方中主藥黃芪中的主要活性成分黃芪甲苷為指標(biāo), 采用HPLC-ELSD法測定其含量, 通過方法學(xué)考察表明,本方法靈敏度高, 準確可靠, 可用于三草鼻咽清煎膏劑內(nèi)在質(zhì)量的控制。

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