朱思雅，王夢琳 ，金 娟

肝細胞癌是現如今社會最為常見的惡性腫瘤之一，又因其惡性程度高，且發(fā)生發(fā)展速度較快，治療困難，而一直是臨床研究的重點和熱點之一[1]。阿司匹林是應用最早，最廣泛和最常用的非甾體類解熱鎮(zhèn)痛抗炎風濕藥，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗風濕和抗血小板聚集等的眾多的藥理作用，阿司匹林發(fā)揮藥效較快且藥效穩(wěn)定，超劑量易于被發(fā)現和解決，很少發(fā)生變態(tài)反應。長期規(guī)律使用阿司匹林者和未服用阿司匹林者相比，可有效降低癌癥的發(fā)生、增殖和轉移[2-3]。細胞自噬是細胞在自噬相關基因的調控下利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程，發(fā)生應激時，細胞自噬可以阻止致癌的損傷蛋白質和細胞器的累積，阻止細胞的癌變；但是如果腫瘤形成，細胞自噬為癌細胞提供豐富的營養(yǎng)，促進腫瘤生長。因此，在腫瘤進展的過程中，細胞自噬的作用表現出了兩面性，細胞自噬與腫瘤的關系十分復雜且目前尚未完全闡明。該研究旨在研究一定濃度的阿司匹林對人肝癌HepG2細胞具有增殖抑制作用，并進一步探討一定濃度阿司匹林對人肝癌HepG2細胞增殖抑制作用與細胞內自噬的聯系。

1 材料與方法

1.1細胞株人肝癌HepG2細胞系購自中國科學院上海細胞庫。

1.2主要試劑阿司匹林購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；腺苷酸活化蛋白激酶(the expression of Adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抗體購自英國艾美捷科技有限公司；小牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自杭州市四季青公司;辣根酶標記的β-actin、辣根酶標記抗兔lgG抗體和辣根酶標記抗鼠lgG抗體購自北京中杉金橋生物有限公司；吖啶橙(acridine orange，AO)染料、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國西格瑪奧德里奇公司。

1.3主要儀器SW-CI-2F超凈工作臺(中日合資蘇州安泰空氣技術有限公司)；Multiskan Go[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；超純水儀(上海力新儀器有限公司)。

1.4方法

1.4.1細胞培養(yǎng) 將人肝癌HepG2細胞從液氮中取出復蘇，然后在含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2MTT法檢測人肝癌HepG2細胞的增殖活力 HepG2細胞用含10%小牛血清的DMEM稀釋成5×104/ml濃度，接種于96孔培養(yǎng)板內，每孔100 μl,細胞培養(yǎng)過夜。當細胞生長到60%～70%時，加入用DMEM配制的不同濃度阿司匹林，各組的終濃度為：2.5、5、10、20 mmol/L每孔加入100 μl(每組設4個復孔)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h,每孔加入5 mg/ml濃度的新鮮配制的MTT溶液 20 μl,繼續(xù)孵育4 h后，棄去各孔中的培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μl后室溫下在搖床上振蕩10 min，酶標儀490 nm波長檢測吸光度值。

1.4.3平板克隆實驗 取生長對數期的人肝癌HepG2細胞，常規(guī)消化離心收集細胞的沉淀，用含有血清的DMEM培養(yǎng)基使其重懸成為單細胞懸液(1×104孔)，加入用DMEM配制的含不同濃度阿司匹林(2.5、5、10、20、40 mmol/L)的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，后撤去含藥培養(yǎng)液，換上正常含血清的DMEM培養(yǎng)液。置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3周左右。經常觀察，當培養(yǎng)皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加入5 ml的4%多聚甲醛固定細胞，固定15 min。去除固定液，加入適量GIMSA應用染色液，染色30 min，使用流水緩慢清洗去染色液，空氣干燥，倒置。用肉眼直接計數克隆，后計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?%) =(克隆數/接種細胞數)×100%。

1.4.4AO熒光染色 取生長對數期細胞，常規(guī)消化離心，接種于24孔細胞培養(yǎng)板中(2×104/500 μl每孔),待細胞貼壁后棄去原有培養(yǎng)液，換上用DMEM培養(yǎng)液配制的不同濃度阿司匹林(10、20 mmol/L)于37 ℃、5% CO2下孵育，培養(yǎng)液僅含DMSO組作對照組。培養(yǎng)2、4、6 h后每孔加入100 μl AO染液(1 μg/ml)繼續(xù)孵育40 min，棄上清液，95%乙醇溶液固定5 min，PBS清洗細胞3～4次，每次5 min，倒置熒光顯微鏡立即觀察。

1.4.5Western blot法檢測蛋白的表達 取生長對數期的人肝癌HepG2細胞，細胞裂解法冰上裂解細胞提取蛋白，BCA法蛋白定量，變性蛋白加入到SDS-PAGE凝膠進行電泳，恒壓將蛋白轉至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉1 h。一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，二抗(1 ∶10 000)室溫孵育2 h,TBST洗膜，顯影。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0軟件進行分析，組間比較采用One-Way ANOVA檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1MTT法測定阿司匹林對HepG2細胞增殖活力的影響阿司匹林10 mmol/L作用于人肝癌HepG2細胞24 h后對人肝癌HepG2細胞產生增殖抑制作用，與未加阿司匹林的對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=24.5,P<0.01)。阿司匹林10 mmol/L作用于細胞48 h后對人肝癌HepG2細胞產生增殖抑制作用，與未加入阿司匹林的對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=34.3,P<0.01)。40 μmol/L自噬抑制劑氯喹(chloroquine diphosphate salt,CQ)促進10 mmol/L阿司匹林對HepG2細胞的增殖抑制,差異有統(tǒng)計學意義(F=163.8,P<0.01)。10 mmol/L阿司匹林能抑制人肝癌HepG2細胞的增殖活力，合用自噬抑制劑CQ后CQ促進這種增殖抑制。見圖1、2。

圖1 24、48 h阿司匹林對人肝癌HepG2細胞增殖活力的影響

A：阿司匹林作用24 h：B：阿司匹林作用48 h；1：對照組；2、3、4、5：阿司匹林2.5、5、10、20 mmol/L；與對照組比較：**P<0.01

圖2 CQ聯合阿司匹林對HepG2細胞增殖活力的影響

1：CQ 40 μm;2：阿司匹林 10 mmol/L;3：CQ+阿司匹林；與阿司匹林10 mmol/L組比較：**P<0.01

2.2平板克隆實驗細胞克隆形成率表示接種細胞后貼壁的細胞成活并形成克隆的數量，貼壁后的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆，而形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞，反映細胞群體依賴性和增殖能力。阿司匹林(2.5、5、10、20、40 mmol/L)對HepG2細胞有抑制作用，見圖3。

圖3 阿司匹林作用后HepG2的相對克隆率

A：對照組；B、C、D、E、F：阿司匹林2.5、5、10、20、40 mmol/L；與對照組比較：**P<0.01

2.3AO熒光染色AO熒光染色法利用對pH敏感標記酸性囊泡細胞器結構，是一種具有細胞滲透性的熒光染色方法，DNA和胞質為亮綠色，若為酸性囊泡AO發(fā)出紅色熒光，是常用檢測細胞自噬的方法之一。10、20 mmol/L濃度的阿司匹林處理后，出現了橘紅色的自噬小體。實驗結果見圖4。

2.4Westernblot法測定AMPK、mTOR蛋白表達阿司匹林(10、20 mmol/L)作用于人肝癌HepG2細胞24 h后,提取細胞內蛋白，檢測蛋白表達。與對照組比較，AMPK蛋白表達增加，mTOR蛋白下調。實驗結果見圖5。

3 討論

肝細胞癌是世界范圍內最常見的實體瘤之一，也是死亡率最高的疾病之一。乙型肝炎病毒(hepadnavividae， HBV)感染是肝細胞癌發(fā)生發(fā)展的主要病因之一。HBV是一種有包膜病毒，含有一個環(huán)狀的部分雙鏈結構的DNA基因組，為親肝細胞性DNA病毒，HBV進入體內可利用由多聚酶編碼的DNA多聚酶-逆轉錄酶復制。病毒特異性T細胞反應可激活其他炎癥細胞及干擾素、腫瘤壞死因子等細胞因子釋放，從而抑制病毒復制并清除感染細胞。沒有足夠的病毒特異性T細胞反應，HBV以穩(wěn)定形式持續(xù)存在，其特殊區(qū)域復制被認為是導致慢性HBV感染的原因。對HBV持續(xù)性的炎癥反應即慢性活動性肝炎，可引起肝細胞壞死、肝纖維化、可能導致肝硬化。HBV引起的慢性活動性肝炎和肝硬化是肝細胞癌的主要危險因素。我國人口眾多，又是HBV感染的高發(fā)國家之一，由乙肝進展所致的HCC給我國醫(yī)療資源帶來了巨大的的負擔。然而，目前尚無預防和治療HBV相關的抗HCC的有效藥物。研究[4]表明非甾體抗炎藥阿司匹林能顯著減少肝內HBV特異性T細胞和非特異性炎性細胞，阻止HBV相關的HCC的發(fā)生和發(fā)展。因此，本研究推測阿司匹林可能在HBV相關的HCC預防和治療中發(fā)揮重要作用。自噬是最近研究熱點之一，細胞在正常情況下很少發(fā)生自噬，除非有誘發(fā)因素，且誘發(fā)因素眾多，也是最近研究熱點。細胞在接受到自噬誘導信號之后會在胞質形成一個像“脂質體”樣的膜結構，然后不斷擴張，呈扁平狀，不斷延伸，將胞質中的任何成分，全部攬入其中，成為密閉的球狀的自噬體。電鏡下可觀察到。自噬體與溶酶體融合，期間自噬體的內膜和內容物被溶酶體酶降解合為一體，產物(氨基酸、脂肪酸等)被輸送到胞質中，供細胞重新利用，殘渣被排出細胞外或留在胞質中。AMPK被稱為細胞的代謝和能量的感受器。在細胞代謝中起作用，而腫瘤細胞內部代謝紊亂，會引起AMPK活性變化[5-6]。腫瘤抑制因子LKB1作用于其上游，P53和TSC2為其下游底物[7-8]。AMPK既能通過mTOR-TSC2負向調控自噬，又能磷酸化ULK1引發(fā)自噬[9-10]。以上都說明AMPK在自噬中起到至關重要的作用。本研究顯示，10 mmol/L濃度的阿司匹林對人肝癌HepG2細胞具有增殖抑制作用且和自噬抑制劑CQ合用時此作用會被促進。10 mmol/L濃度阿司匹林作用于人HepG2細胞時會出現自噬小體，并且增加相關蛋白AMPK的表達而降低mTOR蛋白表達。提示10 mmol/L濃度的阿司匹林對人肝癌HepG2細胞增殖抑制作用與自噬有關。

圖4阿司匹林作用人肝癌HepG2細胞不同時間后細胞經AO染色×400

A：對照組；B：阿司匹林10 mmol/L；C：阿司匹林20 mmol/L；1:2 h；2：4 h；3：6 h

圖5 Western blot法測定相關蛋白表達

與HepG2組AMPK蛋白的表達比較：**P<0.01；與HepG2組mTOR蛋白表達比較：##P<0.01

[1] 范 潔，張 磊，王 嘯.人參皂苷Rk3對肝癌HepG2細胞凋亡的影響[J]. 安徽醫(yī)科大學學報,2016,51(11):1604-8.

[2] Rothwell P M, Wilson M, Price J F,et al. Effect of daily aspirin on risk of cancer metastasis: a study of incident cancers during randomised controlled trials[J]. Lancet, 2012,379(9826):1591-601.

[3] Burn J, Gerdes A M,Macrae F,et al. Long-term effect of aspirin on cancer risk in carriers of hereditary colorectal cancer: an analysis from the CAPP2 randomised controlled trial[J]. Lancet,2011,378(9809):2081-7.

[4] Futakuchi M, Ogawa K, Tamano S,et al. Suppression of metastasis by nuclear factor kappaB inhibitors in aninvivolung metastasis model of chemically induced hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Sci,2004, 95(1):18-24.

[5] Hawley S A, Fullerton M D, Ross F A,et al. The ancient drug salicylate directly activates AMP-activated protein kinase[J]. Science,2012,336(6083):918-22.

[6] Din F V, Valanciute A, Houde V P,et al. Aspirin inhibits mTOR signaling, activates AMP-activated protein kinase, and induces autophagy in colorectal cancer cells[J]. Gastroenterology,2012,142 (7):1504-15.

[7] Okoshi R, Ozaki T, Yamamoto H,et al. Activation of AMP-activated protein kinase induces p53-dependent apoptotic cell death in response to energetic stress[J]. J Biol Chem,2008,283(7):3979-87.

[8] Imamura K, Ogura T, Kishimoto A,et al. Cell cycle regulationviap53 phosphorylation by a 5′-AMP activated protein kinase activator, 5-aminoimidazole- 4-carboxamide-1-beta-D-ribofuranoside, in a human hepatocellular carcinoma cell line[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 287(2):562-7.

[9] Jones R G, Plas D R, Kubek S,et al. AMP-activated protein kinase induces a p53-dependent metabolic checkpoint[J]. Mol Cell,2005,18(3):283-93.

[10] Gwinn D M, Shackelford D B, Egan D F,et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint[J]. Mol Cell,2008,30(2):214-26.