湯繼春，袁 媛，金 偉，杜瀛瀛，潘躍銀

目前80%肺癌患者為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，5年生存率約15%，預(yù)后不佳[1]。分子靶向治療在肺癌治療中占有重要地位，第一、二代表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor -tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKI)前期治療效果顯著，但半年至一年后出現(xiàn)耐藥[2]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種耐藥機(jī)制，包括表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)擴(kuò)增、遺傳損傷、并行旁路的激活等[3]。第三代EGFR-TKI 中AZD9291(osimertinib, 奧斯替尼)已被批準(zhǔn)用于T790M陽(yáng)性NSCLC患者，但耐藥仍不可避免[4]。信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription, STAT3)在多種腫瘤，如頭頸、肺和乳腺癌中被激活。STAT3的持久活化具有致癌性，有報(bào)道[5-6]封阻STAT3信號(hào)通路可抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，增強(qiáng)抗癌藥物的敏感性。該研究主要檢測(cè)AZD9291作用H1975后胞內(nèi)信號(hào)通路變化，以及抑制STAT3通路是否增強(qiáng)AZD9291的抑瘤作用，為以STAT3為靶點(diǎn)的NSCLC治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料RPMI-1640、FBS購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；Western blot化學(xué)發(fā)光劑購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司；H1975細(xì)胞由廣東省肺癌研究所惠贈(zèng)；AZD9291由英國(guó)Astra Zeneca公司惠贈(zèng)； STAT3抑制劑(商品名S3I-201)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；Annexin V-FITC凋亡試劑盒購(gòu)自長(zhǎng)沙貝博生物科技公司；磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B, p-AKT)和蛋白激酶B(protein kinase B,AKT )抗體、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase, p-ERK)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶抗體(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、p-STAT3和STAT3抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) H1975細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS、青鏈霉素各100 U/ml的10 ml RPMI-1640培養(yǎng)液中，常規(guī)培養(yǎng)在恒溫培養(yǎng)箱，傳代時(shí)間為2～3 d，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于研究。

1.2.2MTT法 取96孔板，將H1975細(xì)胞接種入內(nèi)，每孔數(shù)量為2 000個(gè)，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。分為AZD9291單藥組(AZD9291)、STAT3抑制劑S31-201單藥組(S31-201)。單藥實(shí)驗(yàn)組濃度梯度設(shè)定為6組，每組6個(gè)復(fù)孔，使用AZD9291單藥的處理組將濃度設(shè)定為為2.625、5.25、10.5、21、42、84 nmol/L；STAT3抑制劑S31-201單藥組實(shí)驗(yàn)濃度分別設(shè)計(jì)為11.25、22.5、45、90、180、360 μmol/L。后以6種不同濃度AZD9291和STAT3抑制劑聯(lián)合給藥培養(yǎng)72 h后，各孔加MTT溶液20 μl，反應(yīng)4 h后棄去上清液，每孔150 μl DMSO，酶標(biāo)儀震蕩后在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度(optical density，OD)值。細(xì)胞的增殖抑制率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)]×100%。分別計(jì)算AZD9291和STAT3抑制劑的半數(shù)抑制濃度(half inhibitory concentration，IC50)和聯(lián)合指數(shù)(combination index，CI)。對(duì)于后續(xù)的細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、Western blot實(shí)驗(yàn)均采用 AZD9291濃度20 nmol/L, STAT3抑制劑S31-201濃度100 μmol/L作為實(shí)驗(yàn)組用藥濃度。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將H1975接種在6孔板中，密度為1×108個(gè)/L ，實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組，AZD9291單藥組，STAT3抑制劑單藥組，以及AZD 9291和STAT3抑制劑聯(lián)合用藥組。加入預(yù)定濃度的藥物，使其在新培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h。PBS沖洗2遍，胰酶消化收集。離心機(jī)離心5 min，棄上清液，保留細(xì)胞。分別每管加入Annexin-V結(jié)合液400 μl，5 μl的Annexin-V染色，10 μl的PI染色，避光孵育5 min。1 h內(nèi)置流式機(jī)檢測(cè)。

1.2.4Western blot法 按1.2.3方法進(jìn)行分組及藥物處理72 h，消化收集細(xì)胞，蛋白裂解液提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，沸水水浴15 min，離心機(jī)調(diào)為12 000 r/min，高速離心10 min。將樣品加入10% SDS-PAGE中電泳，4 ℃條件下80 V轉(zhuǎn)膜30 min，后調(diào)為120 V轉(zhuǎn)膜70 min，完成后5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h。加入以1 ∶1 000比例稀釋的抗體，4 ℃冰箱過夜。TBST洗滌3遍后，加入二抗(1 ∶5 000)，室溫孵1 h，TBST再洗滌3遍。后加入ECL發(fā)光劑，暗室中進(jìn)行顯影結(jié)果。各蛋白的灰度值采用Image J軟件分析。

2 結(jié)果

2.1AZD9291和STAT3抑制劑對(duì)H1975細(xì)胞的增殖抑制作用根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇藥物作用72 h，MTT結(jié)果顯示，AZD 9291和STAT3抑制劑對(duì)H1975細(xì)胞的IC50值分別為(20.00±3.65)nmol/L和(96.00±15.30)μmol/L，并且隨著藥物濃度的遞增，增殖抑制作用也隨之增強(qiáng)，具有濃度依賴性(F=113.89、138.68，P<0.05)。見圖1。

不同濃度的AZD 9291聯(lián)合STAT3抑制劑處理H1975細(xì)胞72 h，相對(duì)于單藥組，兩藥聯(lián)合后增殖抑制作用明顯增強(qiáng)(F=36.39，P<0.05)，各聯(lián)合藥物劑量組的CI均<1，表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)(圖2)。

圖1 MTT法檢測(cè)AZD 9291或STAT3

圖2 AZD 9291聯(lián)合STAT3抑制劑作用于H1975細(xì)胞的CI

2.2AZD9291和STAT3抑制劑聯(lián)合促進(jìn)H1975的凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)照組中細(xì)胞凋亡率為(3.59±0.62)%，AZD9291和STAT3抑制劑單藥處理組的細(xì)胞凋亡率分別為(6.09±0.76)%和(10.13±1.57)%，兩藥聯(lián)合后凋亡率上升為(22.18±3.24)%。聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率較單獨(dú)用藥組均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=84.043，P<0.05)。見圖3。

2.3AZD9291和STAT3抑制劑單藥及聯(lián)合用藥對(duì)H1975細(xì)胞AKT、p-AKT、ERK、p-ERK、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)的影響如圖4示，檢測(cè)顯示與對(duì)照組相比較，AZD9291可明顯上調(diào)p-STAT3 蛋白的水平，而p-AKT和p-ERK蛋白的表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=45.80、20.66、232.02，P<0.05)；兩藥聯(lián)合組p-STAT3蛋白水平與AZD9291單藥組相比明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.80，P<0.05)，見圖5。

3 討論

STAT蛋白家族可以被多種細(xì)胞因子受體激活，其中最受關(guān)注的為STAT3，多種促炎因子和生長(zhǎng)因子可以使其活化，在多種人類惡性腫瘤中STAT3出現(xiàn)明顯異常激活，其參與了多種腫瘤的致癌信號(hào)通路的傳遞及胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的信號(hào)傳遞[7]。在正常情況下，胞內(nèi)STAT3信號(hào)的激活訊速但持續(xù)時(shí)間短暫，受多種負(fù)性調(diào)控因子的調(diào)節(jié)。近年多種研究[8-10]證實(shí)，在白血病、肺癌、肝癌、乳腺癌及前列腺癌等中STAT3均有異常而持續(xù)的激活。STAT3 參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成及抗凋亡作用。抗凋亡蛋白、細(xì)胞周期蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等的表達(dá)增高均與STAT3表達(dá)存在密切關(guān)系[7]。因此，深入研究STAT3 在腫瘤中機(jī)制，從而設(shè)計(jì)針對(duì)STAT3 靶向治療藥物，可能為腫瘤治療的提供一個(gè)有效途徑。

以表皮生長(zhǎng)因子受體為靶點(diǎn)的分子靶向治療在 NSCLC 的治療中日益占據(jù)重要位置，然而患者對(duì)靶向藥物有耐藥現(xiàn)象，其中大約一半耐藥機(jī)制是 EGFR 的T790M 位點(diǎn)突變或c-MET 擴(kuò)增[11-12]，但是余下耐藥機(jī)制尚未完全闡明，部分研究[8-10]表明與STAT3的異?；罨嘘P(guān)。研究[13-14]表明STAT3 可以增加腫瘤細(xì)胞在治療藥物中的適應(yīng)能力，導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生耐藥。Chiu et al[13]研究發(fā)現(xiàn)p53的穩(wěn)定劑 RITA 與吉非替尼聯(lián)合增加對(duì) H1650的敏感性，主要機(jī)制為抑制STAT3的活性。同樣的，STAT3 抑制劑WP1066 或小干擾RNA可以導(dǎo)致H1650 的增殖減低；以上證實(shí)STAT3對(duì)維持H1650 在吉非替尼中的耐藥有至關(guān)重要的作用。Kim et al[14]研究表明，選擇H1975 和 PC9/GR這兩種攜帶T790M 突變的 NSCLC 細(xì)胞株進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)阿法替尼可以激活 IL-6R/JAK1/STAT3 信號(hào)通路，主要通過自分泌IL-6因子。使用信號(hào)通路阻斷劑如JAK 抑制劑或是IL-6中和抗體可以顯著增強(qiáng)了阿法替尼的抗腫瘤的敏感性。以上結(jié)果同樣在小鼠體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)中證實(shí)。

有研究[15]顯示通過一些藥物提前處理后能夠直接或是間接激活STAT3，使得腫瘤出現(xiàn)耐藥。Li et al[15]報(bào)道稱在NSCLC中，厄洛替尼抑制PTPMeg2 表達(dá)，使得STAT3中Y705磷酸化并上調(diào)bcl-2/bcl-xl的基因和蛋白表達(dá)，存活信號(hào)通路的激活使得細(xì)胞對(duì)厄洛替尼耐藥。厄洛替尼聯(lián)合STAT3 抑制劑 Nidosamid或是小干擾RNA可以逆轉(zhuǎn)HCC827的耐藥，以上結(jié)果同樣在移植瘤中證實(shí)，厄洛替尼聯(lián)合STAT3 抑制劑增強(qiáng)瘤組織的縮小和凋亡。這些發(fā)現(xiàn)揭示了新的EGFR-TKI可能的耐藥機(jī)制，為克服肺癌靶向藥物耐藥提供了一個(gè)新的治療策略。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)AZD 9291和STAT3抑制劑單藥及聯(lián)合作用對(duì)H1975細(xì)胞凋亡率的影響

A:對(duì)照組；B:AZD9291單藥組；C：STAT3抑制劑單藥組；D: AZD9291+STAT3抑制劑聯(lián)合用藥組；E：AZD9291與STAT3抑制劑單藥及聯(lián)合作用對(duì)H1975細(xì)胞凋亡率影響的比值；與AZD9291+STAT3抑制劑聯(lián)合用藥比較：*P<0.05

圖4 AZD9291作用于H1975細(xì)胞后信號(hào)通路蛋白的變化

A:AZD9291單藥作用細(xì)胞后p-AKT及AKT蛋白變化；B:AZD9291單藥作用細(xì)胞后p-ERK及ERK蛋白變化；C: AZD9291單藥作用細(xì)胞后p-STAT3及STAT3蛋白變化；1：對(duì)照組；2：10 nmol/L；3：20 nmol/L；4：40 nmol/L；與對(duì)照組比較：*P<0.05；與10 nmol/L組比較：#P<0.05；與20 nmol/L組比較：△P<0.05

圖5 AZD 9291和STAT3抑制劑單藥及聯(lián)合后對(duì)H1975信號(hào)通路中p-STAT3蛋白表達(dá)的影響

為了解使用AZD9291后細(xì)胞內(nèi)主要細(xì)胞通路變化情況，本實(shí)驗(yàn)主要檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)EGFR下游主要三條信號(hào)通路的變化。其中AKT及ERK通路在低劑量組即出現(xiàn)明顯抑制，但STAT3信號(hào)通路卻異常激活，且磷酸化STAT3隨劑量增高而增高。雖然AZD9291治療效果顯著，但不可避免地會(huì)出現(xiàn)耐藥，STAT3的異常激活可能為AZD9291的治療效果欠佳的一個(gè)因素，所以予以AZD9291聯(lián)合STAT3抑制劑應(yīng)用了解其對(duì)H1975細(xì)胞系增殖情況影響。通過體外實(shí)驗(yàn)，在H1975細(xì)胞株中顯示AZD 9291和STAT3抑制劑聯(lián)合應(yīng)用對(duì) H1975 細(xì)胞的抗增殖作用明顯強(qiáng)于各單藥組，經(jīng)過計(jì)算其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)，計(jì)算CI顯示，AZD9291和STAT3抑制劑聯(lián)合的CI<1,表明兩者聯(lián)合具有明顯的協(xié)同作用。同時(shí)，通過流式細(xì)胞儀法對(duì)凋亡進(jìn)行檢測(cè)，本研究顯示AZD9291和STAT3抑制劑聯(lián)合可明顯促進(jìn) H1975細(xì)胞凋亡的作用。AZD9291在作用H1975后出現(xiàn)STAT3活性明顯增高，其可能進(jìn)一步激活了下游信號(hào)通路抗凋亡蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)抑制劑敏感性降低，所以聯(lián)合應(yīng)用STAT3抑制劑后AZD9291其抑制細(xì)胞增殖作用增強(qiáng)。

綜上所述，AZD9291和STAT3抑制劑聯(lián)用對(duì)攜帶T790M突變的H1975細(xì)胞株具有良好的協(xié)同作用，可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)AZD9291的敏感性，為臨床EGFR-TKIs 獲得性耐藥患者的治療提供新的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)及治療策略。但本實(shí)驗(yàn)僅為體外細(xì)胞研究，尚需進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證其在體內(nèi)的有效性及安全性。

[1] Siegel R L, Miller K D, Jemal A.Cancer statistics,2015 [J].CA Cancer J Clin,2015,65(1):5-29.

[2] 萬(wàn)宜濤,袁 媛,潘躍銀,等.酪氨酸激酶抑制劑高劑量脈沖式給藥克服非小細(xì)胞肺癌獲得性耐藥的體外觀察研究[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 51(4):516-20.

[3] Niu F Y, Wu Y L. Novel agents and strategies for overcoming EGFR TKIs resistance [J]. Exp Hematol Oncol, 2014, 3(1):2.

[4] Govindan R.Overcoming resistance to targeted therapy for lung cancer [J]. N Engl J Med,2015,372(18) :1760-1.

[5] Geiger J L, Grandis J R, Bauman J E. The STAT3 pathway as a therapeutic target in head and neck cancer: Barriers and innovations [J]. Oral Oncol, 2016, 56:84-92.

[6] Zhao C, Li H, Lin H J, et al. Feedback activation of STAT3 as a cancer drug-resistance mechanism [J]. Trends Pharmacol Sci, 2016, 37(1):47-61.

[7] Siveen K S, Sikka S, Surana R, et al. Targeting the STAT3 signaling pathway in cancer: role of synthetic and natural inhibitors [J].Biochim Biophys Acta,2014,1845(2):136-54.

[8] Crescenzo R, Abate F, Lasorsa E, et al. Convergent mutations and kinase fusions lead to oncogenic STAT3 activation in anaplastic large cell lymphoma [J]. Cancer Cell, 2015,27(4):516-32.

[9] Wen W, Wu J, Liu L, et al. Synergistic anti-tumor effect of combined inhibition of EGFR and JAK/STAT3 pathways in human ovarian cancer [J]. Mol Cancer, 2015, 14:100.

[10] Deshmukh S K, Srivastava S K, Bhardwaj A, et al. Resistin and interleukin-6 exhibit racially-disparate expression in breast cancer patients, display molecular association and promote growth and aggressiveness of tumor cells through STAT3 activation[J]. Oncotarget, 2015, 6(13):11231-41.

[11] Wu S G, Liu Y N, Tsai M F, et al. The mechanism of acquired resistance to irreversible EGFR tyrosine kinase inhibitor-afatinib in lung adenocarcinoma patients [J]. Oncotarget, 2016, 7(11):12404-13.

[12] Chabon J J, Simmons A D, Lovejoy A F, et al. Circulating tumour DNA profiling reveals heterogeneity of EGFR inhibitor resistance mechanisms in lung cancer patients[J]. Nat Commun, 2016,7:11815.

[13] Chiu H C, Chou D L, Huang C T, et al. Suppression of Stat3 activity sensitizes gefitinib-resistant non small cell lung cancer cells [J]. Biochem Pharmacol,2011,81(11): 1263-70.

[14] Kim S M, Kwon O J, Hong Y K, et al. Activation of IL-6R/JAK1/STAT3 signaling induces de novo resistance to irreversible EGFR inhibitors in non-small cell lung cancer with T790M resistance mutation [J]. Mol Cancer Ther,2012, 11(10): 2254-64.

[15] Li R,Hu Z,Sun S Y,et al.Niclosamide overcomes acquired resistance to erlotinib through suppression of STAT3 in non-small cell lung cancer [J]. Mol Cancer Ther,2013,12(10):2200-12.