丁 翔，葛圣林，張朝東

肺癌是最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均位居全球癌癥首位[1]。最新研究[2]顯示，2015年我國因肺癌死亡61萬例，占所有癌癥死亡人數(shù)的21.7%，死亡率居我國各種癌癥死亡率之首。非小細胞肺癌(normal small cell carcinoma,NSCLC)是肺癌最常見的類型，約占肺癌總數(shù)的87%。研究[3]顯示，腫瘤微環(huán)境對腫瘤的增殖、侵襲、遷移、黏附能力及新生血管的形成有重要影響，是腫瘤不斷惡化并發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要原因。而缺氧在細胞增殖、血管生成、免疫監(jiān)控、新陳代謝，以及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[4]。腫瘤細胞在應對缺氧微環(huán)境時，能夠上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白和糖酵解相關(guān)酶的表達。葡萄糖是腫瘤無氧酵解主要的能量供給物質(zhì)，在細胞中能夠以糖原的形式儲存，儲存糖原是腫瘤細胞在應對缺氧和營養(yǎng)不足時的能量來源和生存保障。有研究[5]表明，低氧刺激能夠提高腫瘤細胞中糖原水平，并誘導糖原代謝相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄表達。低氧引發(fā)的糖原合成升高，與糖原合成相關(guān)酶的表達水平升高相關(guān)，包括 UGP2、GYS1、GBE1、PGM 和 PPP1R3C。

糖原分支酶(glucogen branching enzyme 1,GBE1)是一種葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，屬α-淀粉酶家族成員。在糖原合成的過程中，能夠催化水解α-1，4-糖苷鍵，將直鏈糖轉(zhuǎn)化成分支糖[6]。有報道[7-8]稱GBE1 在卵巢癌、宮頸癌等腫瘤中的表達水平不同，可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但GBE1在肺癌中的作用尚未有報道。因此，該研究以GEO數(shù)據(jù)庫為基礎，首次探討GBE1在肺癌缺氧狀態(tài)下抑制細胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1試劑人非小細胞肺癌細胞A549細胞購自中國科學院上海細胞庫；Lipo2000、青霉素-鏈霉素溶液、PVDF膜和預染蛋白Marker購自美國Life technology公司；30% 甲叉雙丙烯酰胺溶液購自南京厚百公司；ECL發(fā)光液購自美國Millipore公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、細胞裂解液、PMSF和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；GBE1 siRNA(貨號：sc-78413)及對照siNC購自美國Santa Cruz公司；GBE1質(zhì)粒和對照質(zhì)粒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；β-actin (貨號：ab8226)和GBE1(貨號：ab180596)抗體購自美國Abcam公司；cleaved-caspase-3(貨號：#9664)、bax(貨號：#2774)和 bcl-2(貨號：#4223)抗體購自美國CST公司；Real-time PCR引物由南京金斯瑞公司設計合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：RR047A)與SYBR(貨號：RR430A)購自大連TaKaRa有限公司。

1.2儀器全自動酶標儀(美國Bio Rad公司)；三氣培養(yǎng)箱(型號3131，美國Thermo公司)；Step one Plus Real-time PCR擴增儀(美國Life technology公司)；Tanon 5200 全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能公司)。

1.3方法

1.3.1基于GEO肺癌芯片數(shù)據(jù)的生物信息學分析 在基因表達匯編(gene expression omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載肺癌基因芯片數(shù)據(jù)。每個數(shù)據(jù)集均需符合以下條件:① 數(shù)據(jù)集來自全基因組RNA表達芯片；② 實驗使用人類缺氧肺癌者組織與常氧肺癌組織對照。經(jīng)過篩選，下載基因表達譜公共數(shù)據(jù)集GSE30979[9]中10例缺氧組織和10例常氧組織。將這兩組芯片數(shù)據(jù)導入GCBI(https://www.gcbi.com.cn)在線平臺進行差異基因分析，并對差異基因進行Gene ontology功能富集分析(GO分析)，最后基于KEGG數(shù)據(jù)庫進行信號通路富集分析。

1.3.2細胞常氧和低氧培養(yǎng) 細胞常氧培養(yǎng)的條件：A549細胞用含10% FBS、100 U/ml青霉素及100 mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于 37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。細胞低氧培養(yǎng)的條件：培養(yǎng)液同常氧培養(yǎng)的細胞，置于37 ℃、O2體積分數(shù)為1%、CO2體積分數(shù)為5%和N2體積分數(shù)為94%的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h[10]。6孔板每孔轉(zhuǎn)染50 pmol siRNA，96孔板每孔轉(zhuǎn)染5 pmol siRNA。將siRNA與Lipofectamine 2000混合加入無血清DMEM培養(yǎng)基中，混勻后室溫靜置5 min，加入培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行缺氧處理。A549細胞以5×105個/ml的密度接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染siGBE1或高表達GBE1的質(zhì)粒24 h后，缺氧處理24 h，Western blot檢測細胞GBE1、cleaved-caspase-3、bcl-2和bax蛋白表達水平，real-time PCR法檢測細胞GBE1、bcl-2和bax mRNA水平。

1.3.3MTT 法檢測 GBE1對A549缺氧后細胞活力的影響 將A549懸液調(diào)整為1×105/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μl，分別用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒和GBE1質(zhì)粒，每組6個復孔，48 h后各孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入200 μl DMSO，測定在570 nm下的吸光度。

1.3.4Real-time PCR A549細胞接種于6孔板中，加入TRIzol提取RNA，根據(jù)試劑盒反應體系逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行Real-time PCR檢測。以GAPDH為內(nèi)參計算mRNA相對表達量，各指標的PCR引物序列如下：GAPDH上游引物：5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′，下游引物：5′- ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′； GBE1上游引物：5′- GGAGATCGACCCGTACTTGAA-3′，下游引物：5′- ACATCTGTGGACGCCAAATGA-3′；bcl-2上游引物：5′- GTCTTCGCTGCGGAGATCAT-3′，下游引物：5′-CATTCCGATATACGCTGGGAC-3′；bax上游引物：5′-CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG-3′，下游引物：5′-CCAGCCCATGATGGTTCTGAT-3′；按以下條件進行PCR擴增反應：擴增曲線的反應條件為95 ℃、5 min 1個循環(huán)，95 ℃、5 s，60 ℃、60 s，共40個循環(huán)；熔解曲線的反應條件為95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，95 ℃、15 s，之后用2-ΔΔCt法定量分析目的基因表達情況。

1.3.5Western blot 檢測caspase-3、bax和 bcl-2 蛋白表達 取對數(shù)生長期的細胞，以1 × 105個/ml接種在6孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細胞生長至融合度為70%時轉(zhuǎn)染siNC和siGBE1，缺氧處理24 h后每孔用100 μl RIPA裂解細胞，12 000 r/min離心后取上清液。BCA 法測量樣品中總蛋白濃度。取蛋白樣品(30 μg/孔)加入10%聚丙烯酰胺凝膠，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h，加入一抗(cleaved-caspase-3、bax和bcl-2按1 ∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加入相應二抗(1 ∶5 000稀釋)，常溫孵育 1 h，最后加 ECL 發(fā)光液，用天能5200曝光儀拍照。

2 結(jié)果

2.1差異基因GCBI平臺對上傳的原始芯片數(shù)據(jù)，首先進行芯片信號值的預處理與預過濾，然后使用差異分析方法，對2組基因芯片數(shù)據(jù)進行差異基因的篩選。差異基因的篩選條件為：Q值<0.05，得到206個差異基因，其中上調(diào)的基因82，下調(diào)的基因124。本研究選取差異最大的20個基因進行排序并聚類分析?；虮磉_譜的聚類結(jié)果見圖1，GBE1在缺氧肺癌組織中的表達水平較常氧組織相比升高2.32倍，是兩組基因芯片差異最大的基因。

2.2GO富集分析將206個差異基因用DAVID軟件進行GO富集分析(FDR<0.01)，結(jié)果顯示這些基因富集在細胞周期、細胞增殖等生物學進程和核分裂調(diào)控等分子功能上。GO富集排名前20的結(jié)果見表1。由表1可知，肺癌組織缺氧可能會影響GBE1所涉及的碳水化合物代謝過程(GO:0005975)和小分子代謝過程(GO:0044281)。

表1 GO富集分析結(jié)果

圖1 差異基因的聚類圖

注：紅色代表相對較高的表達，綠色代表相對較低的表達，黑色代表沒有變化，每一列代表一個樣本，每一行代表一個基因

2.3KEGG通路分析將206個差異基因進行KEGG通路分析，結(jié)果顯示這些基因顯著富集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工信號通路、HIF-1信號通路、細胞周期、細胞代謝等30個有統(tǒng)計學意義的相關(guān)通路(P<0.05)，Pathway分析排名前10的通路見表2。

表2 KEGG通路分析結(jié)果

2.4GBE1對A549缺氧后的細胞活力的影響與常氧組相比，缺氧可以分別增加A549細胞GBE1蛋白和mRNA水平(2.67±0.28)倍(P=0.0091)和(2.45±0.31)倍(P=0.008 5)；轉(zhuǎn)染siGBE1后，A549細胞GBE1的蛋白和mRNA水平分別降低(0.52±0.09)倍(P=0.007 8)和(0.45±0.07)倍(P=0.008 3)倍；轉(zhuǎn)染GBE1高表達質(zhì)粒后，A549細胞GBE1的蛋白和mRNA的表達水平分別升高(3.39±0.54)倍(P=0.000 3)和(5.53±0.64)倍(P=0.000 6)，見圖2A、2B。

缺氧24 h后，MTT法檢測細胞增殖活性。結(jié)果顯示，與正常組相比，缺氧組A549細胞活力降低至(0.41±0.06)倍(P=0.006 2)，轉(zhuǎn)染siGBE1后A549細胞活力進一步降低至(0.23±0.04)倍(P=0.032 1)，而高表達GBE1可以升高缺氧造成的細胞活力至(0.89±0.12)倍(P=0.007 7)，見圖2C。

圖2 GBE1對A549缺氧后的細胞活力的影響

A：Western blot檢測A549細胞GBE1蛋白的表達水平；B：Real-time PCR檢測A549細胞GBE1 mRNA水平；C：MTT法檢測A549細胞活力；1：常氧對照組；2：缺氧組；3：siGBE1+缺氧組；4：GBE1+缺氧組：與常氧對照組比較：**P<0.01；與缺氧組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.5GBE1對A549細胞缺氧處理后caspase-3、bax和bcl-2表達的影響與常氧組相比，缺氧能夠顯著增強cleaved-caspase-3和bax蛋白表達水平(5.48±0.43)倍(P=0.000 2)和(4.29±0.37)倍(P=0.000 9)，降低bcl-2表達至(0.21±0.06)倍(P=0.008 1)。敲降GBE1能夠進一步上調(diào)cleaved-caspase-3和bax表達(6.98±0.67)倍(P=0.001 3)和(6.72±0.90)倍(P=0.008 3)倍，降低bcl-2表達至(0.13±0.02)倍(P=0.012 9)，促進細胞凋亡。而高表達GBE1可以降低cleaved-caspase-3和bax表達水平分別至(1.48±0.23)倍(P=0.001 2)和(2.78±0.36)倍(P=0.001 2)，升高bcl-2蛋白和mRNA表達水平至(0.88±0.06)倍(P=0.002 5)和(0.78±0.11) 倍(P=0.002 3)，逆轉(zhuǎn)缺氧造成的細胞凋亡。見圖3。

圖3 GBE1對A549細胞缺氧處理后caspase-3、bax和bcl-2表達的影響

A： Western blot檢測A549細胞cleaved-caspase-3、bcl-2和bax蛋白的表達水平；B：Real-time PCR檢測A549細胞bax和bcl-2 mRNA水平；1:常氧對照組；2:缺氧組；3:siGBE1+缺氧組；4:GBE1+缺氧組;與常氧對照組比較：*P<0.05，**P<0.01;與缺氧組比較：#P<0.05

3 討論

近年來，隨著我國環(huán)境污染加重、人口老齡化加劇，肺癌的發(fā)病率和死亡率居高不下。這一方面是由于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、易感人群遺傳基因異常等引起，另一些方面是由于肺癌細胞產(chǎn)生多藥耐藥、侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制不明[11]。因此，深入研究肺癌細胞的生物學行為及其分子機制，可以更加準確的評估患者的預后，并找出新的藥物治療靶點。本研究通過分析GEO數(shù)據(jù)庫和GCBI分析平臺首次發(fā)現(xiàn)，GBE1在缺氧肺癌組織中異常高表達，可能與肺癌的缺氧耐受和代謝異常相關(guān)。為進一步揭示GBE1在肺癌缺氧耐受中作用機制，筆者分別向A549細胞轉(zhuǎn)染siRNA和GBE1的質(zhì)粒，在缺氧條件下檢測A549細胞的活力，Western blot和Real-time PCR檢測凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達水平，探討GBE1在缺氧肺癌中的意義。

隨著生物信息學的發(fā)展，基因芯片作為一種高效、大規(guī)模獲取生物信息的技術(shù)得到越來越廣泛的應用。GEO數(shù)據(jù)庫是由美國國家生物技術(shù)中心(national center of Biotechnology Information,NCBI)開發(fā)的用于存儲和查詢基因芯片數(shù)據(jù)的綜合性數(shù)據(jù)庫，為全世界生物工作者進行數(shù)據(jù)挖掘提供了良好的平臺[12]。本研究顯示，在缺氧肺癌組織中GBE1異常高表達，這可能與肺癌的缺氧耐受有關(guān)；對差異基因進行GO分析和信號通路富集分析，發(fā)現(xiàn)肺癌組織缺氧可能會影響GBE1所涉及的碳水化合物代謝過程和小分子代謝過程，而這些差異基因顯著富集于細胞代謝等信號通路。這些結(jié)果同樣證實，GBE1在肺癌缺氧耐受中具有十分重要的作用。

糖原分支的形成一方面增加了糖原水溶性，有利于其貯存，另一方面可為糖原結(jié)合蛋白提供對接位點[13]。糖原不僅能夠在無氧的條件下快速代謝為ATP，為腫瘤細胞應對營養(yǎng)和氧氣匱乏時提供能量支持，維持細胞的生存，而且在蛋白翻譯后的修飾、生物合成以及抗氧化保護過程中發(fā)揮重要作用[14]。但是GBE1在肺癌缺氧耐受中的作用卻鮮有報道。

本研究分別向A549細胞轉(zhuǎn)染siGBE1和GBE1高表達質(zhì)粒，缺氧處理24 h后，檢測GBE1的蛋白和mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)缺氧能夠增加A549細胞GBE1蛋白和mRNA的表達。通過MTT法檢測細胞活力，Western blot和Real-time PCR檢測凋亡相關(guān)cleaved-caspase-3、bcl-2和bax表達水平，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染敲降GBE1后，可以加重缺氧造成的的細胞活力降低，增加促凋亡因子cleaved-caspase-3、bax的表達水平，降低凋亡抑制因子bcl-2的表達水平，從而促進細胞凋亡；高表達GBE1則有相反的效果。因此，GBE1能夠促進肺癌細胞缺氧條件下的代謝，從而使細胞產(chǎn)生缺氧耐受，抑制GBE1的表達可以抑制肺癌細胞的缺氧耐受，促進細胞凋亡。

通過GEO基因芯片數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)挖掘的方法尋找新靶點和研究方向具有便捷、數(shù)據(jù)量大的特點，但還需要設計實驗進行驗證。本實驗利用數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn) GBE1的表達與肺癌缺氧顯著相關(guān)，并通過A549細胞設計試驗驗證了這一結(jié)果，證明了GBE1在肺癌缺氧耐受中的作用。綜上所述，GBE1可以作為治療肺癌缺氧耐受的新靶點，為未來肺癌臨床治療的研究提供新的方向。

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