鐘毓娟，李 麗，李勇文，楊成芳 ，方舒萍，程 琪

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是以關(guān)節(jié)組織慢性炎癥性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的自身免疫性疾病。RA的特征性表現(xiàn)是：滑膜炎癥、滑膜增生，軟骨吸收和骨質(zhì)破壞。大量研究[1-2]顯示RA的病理過(guò)程及疾病的發(fā)生、發(fā)展與滑膜細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等分泌的高水平的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)密切相關(guān)。

白花丹是白花丹科白花丹屬植物。在我國(guó)，主要生長(zhǎng)于廣西、廣東、四川、福建等地區(qū)，民間用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)疼痛、血瘀閉經(jīng)和跌打損傷等。白花丹醌是白花丹的主要活性成分，其具有很強(qiáng)的活血化瘀作用，已證實(shí)其抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗纖維化等作用[3]。白花丹醌抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎研究國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。CIA大鼠模型已被公認(rèn)為是研究人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的經(jīng)典動(dòng)物模型。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)為細(xì)菌內(nèi)毒素，進(jìn)入機(jī)體后可激活單核、巨噬細(xì)胞等，促進(jìn)各種細(xì)胞因子的合成與釋放，是一種能有效地刺激細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)的物質(zhì)，LPS廣泛應(yīng)用于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)建立細(xì)胞炎癥模型[4]。該實(shí)驗(yàn)采用CIA大鼠取滑膜組織作分離和原代培養(yǎng)，LPS作為炎癥刺激因子建立膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes of college induced arthritis,CIA-FLS)細(xì)胞炎癥模型，探討白花丹醌抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡SD大鼠，購(gòu)自桂林醫(yī)學(xué)院，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK桂 2013-0001。

1.2藥物與試劑白花丹醌(批號(hào)：1001468662)、酸可溶性Ⅱ型膠原蛋白(CⅡ)、弗氏完全佐劑和LPS(美國(guó)Sigma公司)；胎牛血清、1640培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶(美國(guó)HyClone公司)；總蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；兔抗鼠MMP-3多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)；兔抗鼠GAPDH一抗和HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(上海生工公司)；大鼠TNF-α ELISA kit(上海逸峰生物公司)；IL-1β ELISA kit(南京森貝伽生物公司)；MMP-3 ELISA kit(上海廣銳生物公司)。

1.3主要儀器CO2培養(yǎng)箱(Model 311，美國(guó)Thermo公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；倒置相差顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)；Molecular Imager Chemi Doc XRS(美國(guó)BIO-RAD公司)； Infinite M200 PRO Microplate reader(瑞士Tecan公司)。

1.4方法

1.4.1CIA大鼠模型制備 按照參考文獻(xiàn)[5]的方法，將酸性CⅡ250 μg注射于大鼠后肢足跖皮內(nèi)致炎，半個(gè)月后重復(fù)免疫1次，造模成功后CIA模型大鼠用于取滑膜細(xì)胞。

1.4.2CIA大鼠滑膜細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[6]，無(wú)菌條件下分離CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜，用D-hanks液沖洗3遍，洗去滑膜表面的血污及附著的脂肪組織，將滑膜剪成約1 mm×1 mm×1 mm的小塊，2 500 r/min離心10 min，棄上清液，加入100 μl胎牛血清，混勻，將其平鋪在培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min使其貼壁，然后輕輕加入適量20%血清1640培養(yǎng)基置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。48 h后倒置顯微鏡下觀察到組織塊周圍有FLS細(xì)胞爬出，呈三角形、橢圓形和不規(guī)則的梭形細(xì)胞等，待細(xì)胞融合成片后，剔除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)。每2～3 d換液1次。待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%密度時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，每3～4 d傳代1次，取第3～4代的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[7]。

1.4.3MTT法檢測(cè)白花丹醌對(duì)LPS作用后CIA-FLS細(xì)胞增殖的影響 MTT操作步驟參照文獻(xiàn)[2]進(jìn)行，LPS對(duì)照組加入含終濃度為100 μg/L 的LPS[8]，各給藥組在LPS對(duì)照組加入LPS作用12 h后加入含各濃度的藥物作用24、48、72 h，甲氨蝶呤組濃度為2.2 μmol/L，各組白花丹醌終濃度分別為0.125、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 μmol/L，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(對(duì)照組OD值-給藥組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以白花丹醌1.0、1.5、2.0 μmol/L 3個(gè)濃度組進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。

1.4.4ELISA法檢測(cè)白花丹醌對(duì)LPS作用后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β和MMP-3含量的影響 將第3～4代的滑膜細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞懸液為3×107/L，接種細(xì)胞至直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞數(shù)為30×104/皿。培養(yǎng)過(guò)夜，細(xì)胞貼壁良好后，CIA對(duì)照組：加入10% 胎牛血清的1640培養(yǎng)液；LPS對(duì)照組：加入含LPS終濃度為100 μg/L 10%胎牛血清1640培養(yǎng)液孵育24 h；甲氨蝶呤組：先加入含甲氨蝶呤終濃度為2.2 μmol/L的培養(yǎng)液24 h，再加入終濃度為100 μg/L LPS共孵育24 h；白花丹醌1.0、1.5、2.0 μmol/L濃度組：先加入終濃度分別為1.0 、1.5 、2.0 μmol/L的白花丹醌孵育24 h，再加入終濃度為100 μg/L LPS共孵育24 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液按各細(xì)胞因子的ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.4.5Western blot檢測(cè)白花丹醌對(duì)LPS作用后CIA-FLS細(xì)胞內(nèi)MMP-3蛋白表達(dá)的影響 同1.4.4分組給藥后，低溫提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，每孔上樣50 μg蛋白，10% SDS-PAGE分離樣品，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別滴加GAPDH(1 ∶1 000)、MMP-3(1 ∶1 000) Ⅰ抗，4 ℃搖床過(guò)夜，洗膜，加 Ⅱ 抗(1 ∶8 000)室溫孵育1 h，洗膜后將超敏ECL發(fā)光液滴加到膜上，當(dāng)條帶充分顯色后，壓X光片，暗室曝光5～10 s，將X膠片進(jìn)行顯影、定影后可見(jiàn)到清晰條帶。所得膠片經(jīng)Molecular Imager Chemi Doc XRS分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1白花丹醌對(duì)LPS作用后CIA-FLS增殖的影響MTT結(jié)果所示，白花丹醌在0.125～0.5 μmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)CIA-FLS細(xì)胞的抑制作用較小，與陽(yáng)性藥物甲氨蝶呤組比較，濃度為1.0 μmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；濃度為1.5～3.5 μmol/L范圍對(duì)細(xì)胞的抑制作用較好(P<0.01，P<0.001)，呈濃度和時(shí)間依賴性。故選取1.0、1.5、2.0 μmol/L 3個(gè)濃度組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)表1。

2.2白花丹醌對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β和MMP-3含量的影響LISA結(jié)果所示，與CIA對(duì)照組比較，LPS明顯上調(diào)了細(xì)胞TNF-α、IL-1β和MMP-3的表達(dá)(P<0.001)，提示CIA-FLS細(xì)胞炎癥模型復(fù)制成功；與LPS對(duì)照組比較，陽(yáng)性藥物甲氨蝶呤或白花丹醌3個(gè)濃度組均能明顯降低細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β和MMP-3的含量(P<0.001)；而與陽(yáng)性藥物甲氨蝶呤組比較，白花丹醌2.0 μmol/L組TNF-α、IL-1β的含量降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.001)；白花丹醌1.5和2.0 μmol/L組MMP-3含量降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.001)。見(jiàn)表2。

2.3白花丹醌對(duì)LPS作用后CIA-FLS內(nèi)MMP-3蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果所示，與CIA對(duì)照組比較，LPS對(duì)照組MMP-3蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.001)；與LPS對(duì)照組比較，陽(yáng)性藥物甲氨蝶呤或白花丹醌作用48 h后，能明顯降低細(xì)胞內(nèi)MMP-3的蛋白含量(P<0.001)；而與陽(yáng)性藥物甲氨蝶呤組比較，白花丹醌1.5和2.0 μmol/L組MMP-3的蛋白含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)圖1。

表1 不同濃度的白花丹醌對(duì)LPS作用后CIA-FLS增殖的影響±s，n=6 )

與甲氨蝶呤組比較：*P<0.01，**P<0.001

表2 白花丹醌對(duì)CIA-FLS 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β和MMP-3含量改變的影響±s，n=6 )

與CIA對(duì)照組比較：*P<0.001；與LPS對(duì)照組比較：#P<0.001；與甲氨蝶呤組比較：△P<0.01，△△P<0.001

圖1 白花丹醌對(duì)LPS作用后CIA-FLS 中的MMP-3表達(dá)的影響

1：CIA對(duì)照組；2：LPS對(duì)照組；3：甲氨蝶呤組；4：白花丹醌1.0 μmol/L組；5：白花丹醌1.5 μmol/L組；6：白花丹醌2.0 μmol/L組；與CIA對(duì)照組比較：*P<0.001；與LPS對(duì)照組比較：#P<0.001；與甲氨蝶呤組比較：△P<0.05，△△P<0.01

3 討論

RA是一種慢性進(jìn)行性的自身免疫障礙性疾病，在世界范圍內(nèi)的平均患病率約1%，我國(guó)患病率為0.35%[9]。RA晚期可出現(xiàn)不同程度的關(guān)節(jié)畸形和功能障礙，是一種致殘率較高的疾病，嚴(yán)重危害人類健康。目前尚無(wú)根治的方法，常用的治療藥物主要有非甾體類抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、改善病情的抗風(fēng)濕藥和生物制劑。

目前認(rèn)為在RA發(fā)病機(jī)制中，滑膜細(xì)胞中的成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS)是RA關(guān)節(jié)損傷的最終效應(yīng)細(xì)胞，通過(guò)表達(dá)細(xì)胞因子和趨化因子等效應(yīng)信號(hào)的精細(xì)調(diào)節(jié)，以自分泌和旁分泌方式刺激或抑制炎癥反應(yīng)，成為關(guān)節(jié)炎癥和關(guān)節(jié)破壞的直接效應(yīng)者[10]?；ぜ?xì)胞的增生是RA一個(gè)突出的特征。RA 滑膜細(xì)胞的異常增殖能分泌大量的細(xì)胞因子是滑膜增生的主要原因。本研究結(jié)果顯示，與陽(yáng)性藥物甲氨蝶呤組相比較，白花丹醌在濃度為1.5～3.5 μmol/L范圍對(duì)CIA-FLS細(xì)胞的增殖有很好的抑制作用(P<0.01，P<0.001)，表明白花丹醌能直接和間接抑制滑膜的增生。

研究[11]顯示，導(dǎo)致RA關(guān)節(jié)內(nèi)炎性細(xì)胞聚集，滑膜組織增生、軟骨及骨降解和破壞的主要因素在于成纖維樣滑膜細(xì)胞具有的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特征及其所分泌的大量促炎性細(xì)胞因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs，其中由單核細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞、關(guān)節(jié)組織中的滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分泌的IL-1β及由主要由單核巨嗜細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α在RA的病程進(jìn)展中處于中心地位。IL-1β是炎癥的始動(dòng)因素，過(guò)度分泌的IL-1β可以刺激滑液和軟骨細(xì)胞合成并釋放前列腺素E2 和膠原酶，引發(fā)滑膜炎癥反應(yīng)、軟骨基質(zhì)崩解。IL-1β還作用于內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨嗜細(xì)胞聚集，加重關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)[12-13]。研究[ 14]顯示，RA患者血清中TNF-α呈高水平分泌與疾病活動(dòng)性或嚴(yán)重性增強(qiáng)密切相關(guān)。TNF-α與IL-1β的效應(yīng)與靶細(xì)胞相似，TNF-α也可以刺激滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞合成前列腺素E2 和膠原酶，引起骨和軟骨吸收的破壞，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生。TNF-α的分泌不但可以刺激巨嗜細(xì)胞增加自身的產(chǎn)生，而且也促進(jìn)IL-1β的合成和分泌，呈正反饋調(diào)節(jié)。因此，抑制IL-1β和TNF-α 的分泌對(duì)控制 RA 的病情和改善預(yù)后非常重要。

基質(zhì)金屬蛋白酶是一組需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子的蛋白水解酶，MMPs幾乎能水解細(xì)胞外基質(zhì)的各種蛋白成分，導(dǎo)致關(guān)節(jié)韌帶、骨和軟骨的破壞。MMPs廣泛存在于各種結(jié)締組織中，MMP-3被認(rèn)為與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)系最為密切。Ma et al[15]研究發(fā)現(xiàn)，RA患者血清中MMP-3異常增高，是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷的一種生物標(biāo)志物。MMP-3這一系統(tǒng)性的炎癥標(biāo)志物，現(xiàn)已被認(rèn)為是誘導(dǎo)軟骨降解最重要的蛋白酶，并可作為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜損傷以及預(yù)后的指標(biāo)[2]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白花丹醌能有效抑制CIA-FLS的增殖，明顯降低CIA-FLS培養(yǎng)上清液中細(xì)胞炎性因子TNF-α、IL-1β的分泌和MMP-3的表達(dá)，降低CIA-FLS中MMP-3的蛋白表達(dá)，這可能是白花丹醌抑制CIA-FLS炎癥模型的重要作用機(jī)制之一，也可能是白花丹醌民間用于治療風(fēng)濕性疼痛的有效途徑。本實(shí)驗(yàn)為白花丹醌治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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