胡露露，艾 琦，胡曉燕，楊 梓，王銀龍，沈 軍

目前，體外構(gòu)建人工血管的主要策略是利用提取的原代血管構(gòu)成細(xì)胞，如人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)和功能性血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，vSMCs)重新構(gòu)建血管。然而，較難的原代細(xì)胞分離技術(shù)、有限的原代細(xì)胞增殖能力，以及人體組織來源的稀缺性，嚴(yán)重阻礙了原代細(xì)胞的實際運用。因此，誘導(dǎo)干細(xì)胞成為內(nèi)皮細(xì)胞或血管平滑肌細(xì)胞成為解決該問題的主要思路。

轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)目前較廣泛地用于誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成平滑肌細(xì)胞[1]。研究[2]表明，TGF- Smads信號通路對于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化成平滑肌細(xì)胞起到關(guān)鍵作用。 TGF-β1既可單獨也可以聯(lián)合其他因子共同誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為平滑肌細(xì)胞，例如TGF-β1和骨形態(tài)發(fā)生蛋白4可以誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞分化為平滑肌細(xì)胞，TGF-β1聯(lián)合血小板衍生因子BB可以誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化平滑肌細(xì)胞。因此，該研究的目的是采用TGF-β1生長因子誘導(dǎo)人乳牙牙髓干細(xì)胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)分化為vSMCs，并探索分化的可能機制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞提取及培養(yǎng)收集脫落的乳牙，無菌下提取牙髓組織，剪碎后放入I型膠原酶和中性蛋白酶混合液中消化1 h，然后使用孔徑為70 μm的細(xì)胞篩進行過濾，488 r/min離心5 min，完成后用常規(guī)DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS和1%P/S)重懸并轉(zhuǎn)入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，每3 d換液一次，待生長到70%時消化轉(zhuǎn)入到T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，擴大培養(yǎng)后用于后續(xù)實驗。在SHED進行vSMCs誘導(dǎo)前，對其“多能性”進行評估，使用流式細(xì)胞儀檢測SHED的干細(xì)胞標(biāo)志物(CD45、CD90、CD105、CD73)表達情況，并做成脂、成神經(jīng)和成骨等多向分化能力的鑒定。原代HUVECs和vSMCs購自美國ScienCell公司，并用相應(yīng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)(平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基和內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基均購自美國ScienCell公司)，作為陽性對照。

1.2誘導(dǎo)SHED分化為vSMCs取第4～6代SHED，按照3×103cells/cm2接種，常規(guī)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，換成vSMCs誘導(dǎo)培養(yǎng)基(5% FBS DMEM+不同濃度2.5、5、10、20、30 ng/ml TGF-β1)，獲得誘導(dǎo)后不同時間點SHED-vSMCs。

1.3RT-qPCR按照RNA提取試劑盒說明，提取細(xì)胞樣本的總RNA，取1 μg的總RNA，按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，轉(zhuǎn)成20 μl cDNA，并同樣按照TaKaRa SYBR Premix Ex Taq II試劑盒說明，完成PCR反應(yīng)。本實驗所用引物序列如下：GAPDH上游引物：5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′,下游下物：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′; α-SMA上游引物：5′-CCGACCGAATGCAGAAGGA-3′,下游引物：5′-ACAGAGTATTTGCGCTCCGAA-3′; SM22α上游引物：5′-AGTGCAGTCCAAAATCGAGAAG-3′,下游引物：5′-CTTGCTCAGAATCACGCCAT-3′;Calponin上游引物；5′-GTCAACCCAAAATTGGCACCA-3′,下游引物：5′-ACCTTGTTTCCTTTCGTCTTCG-3′。

1.4Westernblot用RIPA裂解液冰上裂解樣本20 min，后高速離心15 min，收集上清液并用BCA蛋白濃度測定試劑盒測量樣本的蛋白濃度，然后根據(jù)測量得到的蛋白濃度，計算20 μg樣本蛋白所需的劑量，進行Western blot實驗。本實驗所用抗體如下：鼠單克隆抗β-actin抗體(編號：sc-47778)購自美國Santa Cruz公司;兔多克隆抗SM22 alpha抗體 (編號：ab14106)、兔抗Calponin抗體 (編號：ab46794)購自英國Abcam公司。

1.5免疫熒光在誘導(dǎo)前將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中進行誘導(dǎo)，完成誘導(dǎo)后用冰PBS洗2次，然后4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，每次5 min，然后用0.5%的Triton-100通透細(xì)胞5 min，PBS洗3次，每次5 min；使用2%BSA封閉細(xì)胞1 h，然后根據(jù)具體的蛋白孵不同的一抗，4 ℃房過夜，PBS洗3次，每次5 min后孵二抗1 h，PBS洗3次，每次5 min；封片后熒光顯微鏡檢查目的蛋白。本實驗所用抗體如下：α-SMA (編號：A2547)購自德國Sigma-Aldrich公司；SM22 alpha (編號：ab14106)、SMMHC (編號：ab683)、Calponin (編號：ab46794)為一抗，羊抗鼠Alexa Fluor 488(編號：ab150117)和羊抗兔Alexa Fluor 488(編號：ab150077)為二抗，均購自英國Abcam公司。

1.6體外Matrigel血管生成實驗為了研究SHED誘導(dǎo)分化的vSMCs是否可以促進血管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，本研究使用體外Matrigel血管生成實驗，評估SHED-vSMCs在維持血管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性中的作用。將5×105～8×105個細(xì)胞接種到T25培養(yǎng)瓶，以便細(xì)胞24 h后達到80%融合；并將Matrigel從-70 ℃冰箱移放到4 ℃冰箱，同時將48孔板和1 ml槍頭置于4 ℃冰箱；第2天在冰上用預(yù)冷的1 ml槍頭將Matrigel轉(zhuǎn)入預(yù)冷的48孔板(120～200 μl每孔)，迅速置于37 ℃培養(yǎng)箱30 min；常規(guī)消化細(xì)胞，按照5 ∶1比例將HUVECs和SHED-vSMCs用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基重懸成濃度為3.2×105cells/ml的單細(xì)胞懸液，然后取100 μl該單細(xì)胞懸液輕輕滴在已經(jīng)凝固的Matrigel表面，并繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)；于不同時間點在顯微鏡下觀察小管形成情況并隨機選擇5個視野拍照記錄，然后用Image J 軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1酶消化法提取的SHED具有多能干性如圖1所示，流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示SHED表達干細(xì)胞標(biāo)志物CD105，CD90以及CD73，不表達CD45。圖2進一步顯示了SHED具有成骨、成神經(jīng)以及成脂能力。

2.2TGF-β1可誘導(dǎo)SHED分化為vSMCs如圖3A所示，誘導(dǎo)7 d后，TGF-β1上調(diào)了vSMCs特異性標(biāo)志物(α-SMA、SM22α和Calponin)的mRNA表達水平，不同濃度(10、20、30 ng/ml)之間結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，在進一步研究中僅使用10 ng/ml TGF-β1的劑量。

為了獲得最佳的誘導(dǎo)時間，本研究評估不同時間點(第3、5、7天以及第1、2代)10 ng/ml TGF-β1的誘導(dǎo)效果。如圖3B、C所示，vSMCs表型標(biāo)志物的表達在第5天達到最高水平，第7天略有下降，誘導(dǎo)效果能維持到第1和第2代。免疫熒光結(jié)果(圖4)進一步表明了誘導(dǎo)后的SHED表達vSMCs標(biāo)志物。

為了評估SHED誘導(dǎo)為vSMCs的分化效率，通過流式細(xì)胞術(shù)來分析α-SMA、SM22α、Calponin和SM-MHC陽性細(xì)胞的百分比。結(jié)果如圖5所示，這些標(biāo)志物具有較高的表達(α-SMA86.1%，SM22α 93.9%，Calponin 56.8%，SM-MHC 88.2%)。

圖1 細(xì)胞流式儀結(jié)果A：CD105 ；B：CD90 ；C：CD73；D：CD45

圖2 SHED具有成骨、成神經(jīng)及成脂能力A：SHED成骨誘導(dǎo)，茜素紅染色；B：SHED成神經(jīng)誘導(dǎo)×4；C：SHED成脂誘導(dǎo)，油紅o染色×4

圖3vSMCs特異標(biāo)志物在基因水平和蛋白水平上的表達

A:不同濃度TGF-β1誘導(dǎo)下α-SMA、SM22α和Calponin的mRNA表達水平；B、C:10 ng/ml TGF-β1在不同時間點的誘導(dǎo)效果；1：對照組；2：2.5 ng/ml；3：5 ng/ml；4：10 ng/ml；5：20 ng/ml；6：30 ng/ml；7：第3天；8：第5天；9：第7天；10：第1代；11：第2代；12：原始vSMCs

圖4 免疫熒光下vSMCs標(biāo)志物的表達 免疫熒光染色×20

圖5 SHED誘導(dǎo)vSMCs具有較高的誘導(dǎo)效率

2.3SHED誘導(dǎo)分化的vSMCs表現(xiàn)出與原代vSMCs相似的功能特性Matrigel血管形成實驗結(jié)果表明，誘導(dǎo)SHED分化的vSMCs具有與原代vSMCs相類似的功能。如圖6A所示，SHED誘導(dǎo)分化的vSMCs緊密附著在HUVEC形成的三維血管結(jié)構(gòu)的表面，并顯著增加了血管結(jié)構(gòu)的存活時間(圖6B)。

3 討論

血管化組織工程復(fù)合體的構(gòu)建是制約組織工程技術(shù)在臨床上有效應(yīng)用的關(guān)鍵問題。如何讓體外構(gòu)建的組織器官快速獲得血供，從而保證其早期存活以及功能維持，是組織工程學(xué)研究的一個熱點和難點。目前，最有效的策略是在體外構(gòu)建組織器官過程中同時進行預(yù)血管化[3]。預(yù)血管化組織工程復(fù)合體可以迅速與受體形成血管吻合，從而快速建立血液循環(huán)，確保構(gòu)建組織器官內(nèi)部的營養(yǎng)供應(yīng)以及代謝物質(zhì)的排除。預(yù)血管化的方案主要是將血管組成細(xì)胞，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管壁細(xì)胞(血管周平滑肌細(xì)胞vSMCs以及周細(xì)胞Pericytes)，植入人工支架，通過細(xì)胞在支架內(nèi)的增殖以及分化，最終形成類似機體的血管樣結(jié)構(gòu)[4]。因此，用于構(gòu)建血管的種子細(xì)胞特性及組織來源對預(yù)血管化起到?jīng)Q定性作用。受體自身血管組織被認(rèn)為是最合適的細(xì)胞來源，然而由于提取困難、細(xì)胞數(shù)量不足及增殖率低等因素，目前無法在實驗及臨床中進行廣泛應(yīng)用。干細(xì)胞具有多向分化潛能、增殖速度快、來源廣泛等優(yōu)勢，利用干細(xì)胞作為種子細(xì)胞運用于組織工程具有誘人的臨床應(yīng)用前景。

目前，在組織工程預(yù)血管化研究中，研究較多的有胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。有胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是一類具有自我更新、無限增殖和多向分化潛能的細(xì)胞，能夠被誘導(dǎo)為幾乎機體所有類型的細(xì)胞。然而，獲取有胚胎干細(xì)胞所產(chǎn)生的倫理問題和使用過程中存在的免疫排斥反應(yīng)，以及生成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的過程中可能會出現(xiàn)的危險變異從而導(dǎo)致產(chǎn)生一些未知的疾病，使得利用有胚胎干細(xì)胞/誘導(dǎo)多能干細(xì)胞作為種子細(xì)胞處于嚴(yán)重窘境。

最近研究[5]表明，成體干細(xì)胞(骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞以及血管內(nèi)皮前體細(xì)胞)同樣具有定向分化為vSMCs的潛能，然而，獲取這些成體干細(xì)胞需要較為繁瑣的手術(shù)過程，以及常規(guī)誘導(dǎo)方法血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)效率過于低下等問題，限制了其將來的臨床應(yīng)用前景。相對于上述成體干細(xì)胞，SHED具有以下優(yōu)勢：① SHED來源于自然脫落的乳牙，不會對供者產(chǎn)生任何額外的損害；② 由于是自身來源，從而也避免了免疫排斥反應(yīng)；③ 除了表達早期間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物STRO-1和CD146等，SHED亦表達胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志物Oct4、Nanog、SSEA-3、SSEA-4[6]，并具有多向分化能力，如可以分化為成骨/成牙本質(zhì)細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞。另外，SHED最近還被證實能夠分化為內(nèi)皮細(xì)胞[7]，然而，尚未有SHED分化為vSMCs的報道。在本研究中使用生長因子TGF-β1誘導(dǎo)SHED，結(jié)果表明SHED可以分化為功能性的vSMCs。

圖6 Matrigel血管生成實驗結(jié)果 免疫熒光染色×10

本研究采用α-SMA、SM22α、Calponin，SM-MHC作為鑒定vSMCs的表型標(biāo)志物，其中SM-MHC只在可收縮性的vSMCs中表達，結(jié)果表明，SHED在生長因子TGF-β1刺激下，表達這些vSMCs標(biāo)志物。成熟vSMCs同時還需具有相應(yīng)功能，例如穩(wěn)定血管的能力，促進血管形成能力，以及收縮功能。為了評價SHED來源的vSMCs的血管穩(wěn)定能力，本研究進行了Matrigel血管生成實驗，將HUVECs與SHED誘導(dǎo)分化來源的vSMCs在Matrigel上進行共培養(yǎng)，HUVECs在Matrigel上能夠形成血管狀結(jié)構(gòu)，SHED-vSMCs能夠穩(wěn)定HUVECs形成的血管結(jié)構(gòu)，證明了SHED來源的vSMCs具有相應(yīng)的功能。

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