劉芬芬，高 倩，程 民，徐婷娟，任薈蓉，沈國棟

卵巢癌(ovarian cancer, OC)在婦科腫瘤中死亡率排在首位，早期缺乏特異性癥狀，當(dāng)出現(xiàn)明顯癥狀或原發(fā)腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移時，大多數(shù)病例才被發(fā)現(xiàn)。約2/3的高級別卵巢癌患者存在惡性進展，從而引起腫瘤復(fù)發(fā)和化療耐藥。分子靶向治療策略有助于改善卵巢癌患者的預(yù)后，從而提高其生存率[1]。不同信號通路之間的交互作用常常存在于在正常的胚胎器官發(fā)育中，其異常調(diào)節(jié)會促進腫瘤的發(fā)生[2-3]。人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2, HER2)[4]和wnt/β-catenin信號通路[5]已被證實在卵巢癌中存在異常表達及其相關(guān)信號通路過度激活的現(xiàn)象。研究[6]表明HER2與wnt/β-catenin信號通路之間可能存在相互作用而共同促進下游信號的持續(xù)活化，對促進腫瘤細胞自我更新及轉(zhuǎn)移起到重要作用，并推測可能與卵巢癌的耐藥機制相關(guān)。該研究主要檢測HER2與wnt/β-catenin信號通路之間的相互作用，為了解卵巢癌的發(fā)病及耐藥機制提供實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料和試劑人卵巢癌細胞株SKOV3獲贈于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；RIPA裂解液、胰酶消化液、5×蛋白上樣緩沖液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑購自瑞士Roche公司；BCA試劑盒、化學(xué)發(fā)光顯影液購自美國Thermo公司；β-actin、β-鏈蛋白(β-catenin)兔抗人單克隆抗體、T細胞因子4 (T cell factor 4, TCF4)兔抗人單克隆抗體、HER2兔抗人單克隆抗體、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG購自美國Cell Signaling Technology公司；人表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)購自美國Peprotech公司；人重組wnt3a蛋白購自美國R&D Systems公司；小分子抑制劑iCRT14(inhibitor of β-catenin responsive transcription 14, iCRT14)購自英國Tocris公司；HER2、TCF4慢病毒購自上海漢恒生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基的解凍復(fù)蘇后的人卵巢癌細胞株SKOV3。

1.2.2Western blot檢測 提取生長狀態(tài)良好的SKOV3細胞總蛋白，BCA法測定各組蛋白濃度并用PBS調(diào)成一致濃度，加入蛋白上樣緩沖液后于水浴鍋中煮沸8 min，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5% 脫脂牛奶室溫條件下封閉1 h。一抗以兔抗人β-actin為內(nèi)參， 兔抗人β-catenin、TCF4、HER2為目的蛋白，4 ℃孵育過夜。二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG。滴加顯影液后使用化學(xué)發(fā)光成像儀成像并運用Chemi Analysis 分析軟件對蛋白電泳條帶灰度值進行定量分析。蛋白相對定量=目的蛋白灰度值 /同標(biāo)本 β-actin 內(nèi)參灰度值，同時將對照的蛋白相對定量設(shè)為1。每項實驗重復(fù) 3 次。

1.2.3慢病毒感染 提前24 h在6孔板中接種適量密度的SKOV3細胞(約2×105/ml)，待細胞生長達50%～80%面積時即可用于感染。靶向HER2或TCF4不同位點的shRNA-1及shRNA-2包入慢病毒中(漢恒生物科技有限公司)，用作感染。感染當(dāng)天，將細胞換至無血清培養(yǎng)基中，每孔加入10 μl(2×106TU)慢病毒溶液并放回培養(yǎng)箱。6 h后，將細胞換液至含10% FBS的新鮮培養(yǎng)基。48 h后，在熒光顯微鏡下查看轉(zhuǎn)染效率。用適量嘌呤霉素對其進行篩選，然后提取適量細胞檢測HER2或TCF4蛋白量。

1.2.4細胞遷移檢測 收集經(jīng)胰酶消化后生長狀態(tài)良好的SKOV3細胞，離心后用無血清培養(yǎng)基重懸計數(shù)，分為對照組，iCRT14組(5 μg/ml)，shHER2組，shTCF4組，shHER2+EGF組(10 μg/ml)， shHER2+wnt3a組(10 μg/ml)，shTCF4+EGF組(10 μg/ml)和shTCF4+wnt3a組(10 μg/ml)。加入刺激劑混勻后，分別將100 μl含5×103細胞數(shù)的各組細胞懸液加入96孔板中Transwell小室上室，每組3個平行孔；下室均加入200 μl含有EGF生長因子的完全培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)箱孵育，12 h后取出小室，用4%中性福爾馬林固定，棉簽小心擦去上室細胞，結(jié)晶紫染色，蒸餾水洗后用鑷子劃下小室底膜，50%甘油封片。使用10×物鏡明場拍照，隨機選取每個樣本的10個視野進行計數(shù)分析。

1.2.5劃痕實驗 將SKOV3細胞株分別接種到6孔板中，待細胞貼壁生長至融合度約為80%時，用無菌移液器槍頭沿孔中軸線輕輕劃過，然后用PBS洗滌細胞2次，以除去漂浮細胞，并加入含有不同刺激劑的新鮮培養(yǎng)基；放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別于0、20 h后拍照，觀察劃痕愈合情況并測量。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 22.0 軟件進行分析，多組樣本的比較運用單因素方差分析，方差齊者采用LSD-t檢驗，方差不齊者采用Games-Howell 檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1在卵巢癌SKOV3細胞中檢測HER2和TCF4的表達量實驗結(jié)果顯示人卵巢癌SKOV3細胞株高表達HER2和TCF4，使用兩種慢病毒獲得敲低HER2的SKOV3-shHER2和敲低TCF4的SKOV3-shTCF4細胞，Western blot驗證敲低效果(P<0.05)，其中shHER2#2敲低HER2效果更好，shTCF4#2敲低TCF4效果更好，后續(xù)實驗均選擇這兩種慢病毒敲低的SKOV3-shHER2和SKOV3-shTCF4。同時，Western blot結(jié)果還顯示，敲低了HER2的SKOV3細胞，其TCF4和β-catenin的表達也會降低；敲低了TCF4，SKOV3細胞中HER2和β-catenin的表達也同樣降低。結(jié)果表明卵巢癌SKOV3細胞中，HER2和TCF4的表達量呈正相關(guān)性(HER2蛋白：F=54.843；TCF4蛋白：F=109.502；β-catenin蛋白：F=33.146；P<0.05)。Transwell實驗(F=122.423，P<0.05)和劃痕實驗(F=164.466，P<0.05)表明，敲低HER2和TCF4后，SKOV3細胞的轉(zhuǎn)移能力明顯減弱，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1～3。

2.2在卵巢癌SKOV3細胞中HER2和wnt/β-catenin信號通路的活化為了進一步探討卵巢癌中EGFR和wnt信號通路是否存在相互作用，通過加入不同時間梯度的EGF、wnt3a和iCRT14刺激，利用Western blot法檢測HER2、β-catenin和TCF4的變化。結(jié)果顯示加入EGF后，隨著時間的延長，HER2表達量上升(P<0.05)，同時β-catenin和TCF4的表達也明顯增強(P<0.05)；加入wnt3a后，β-catenin和TCF4表達量上升(P<0.05)，同時HER2的表達也明顯增強(P<0.05)；加入iCRT14后，β-catenin和TCF4表達量降低(P<0.05)，同時HER2的表達也明顯減弱(P<0.05)(HER2蛋白：FEGF=15.603，F(xiàn)wnt3a=104.057，F(xiàn)iCRT14=32.034；TCF4蛋白：FEGF=42.557，F(xiàn)wnt3a=26.138，F(xiàn)iCRT14=95.082；β-catenin蛋白：FEGF=11.967，F(xiàn)wnt3a=65.840，F(xiàn)iCRT14=103.599)。結(jié)果表明在卵巢癌中，HER2與wnt/β-catenin信號通路存在相互作用。見圖4。

圖1 Western blot法檢測SKOV3細胞中HER2、β-catenin和TCF4的表達

圖2 Transwell實驗檢測敲低HER2和TCF4的SKOV3細胞遷移能力 ×100

圖3 劃痕實驗檢測敲低HER2和TCF4的SKOV3細胞遷移能力 ×40

2.3Transwell實驗和劃痕實驗檢測卵巢癌SKOV3細胞的遷移能力為了驗證卵巢癌中，HER2與wnt/β-catenin信號通路存在相互作用，通過加入不同時間梯度的EGF、wnt3a和iCRT14刺激，采用Transwell實驗和劃痕實驗檢測SKOV3-shHER2和SKOV3-shTCF4細胞遷移能力的變化。Transwell實驗結(jié)果(SKOV3-shHER2：F=535.616；SKOV3-shTCF4：F=587.493)顯示加入EGF(10 μg/ml)后，SKOV3-shHER2和SKOV3-shTCF4細胞遷移能力增強(P<0.05)；加入wnt3a(10 μg/ml)后，SKOV3-shHER2和SKOV3-shTCF4細胞遷移能力增強(P<0.05)；加入iCRT14(25 nmol/L)后，SKOV3細胞遷移能力明顯減弱(P<0.05)。劃痕實驗(SKOV3-shHER2：F=367.572；SKOV3-shTCF4：F=435.443)和Transwell實驗結(jié)果一致。見圖5、6。

3 討論

近年來，針對腫瘤細胞表面受體的小分子抑制劑和抗體藥物在腫瘤治療領(lǐng)域取得了重要進展。目前已有多種EGFR或HER2抗體和抑制劑被批準(zhǔn)用于乳腺癌、胃癌等腫瘤的臨床治療[7-8]；而多種wnt信號抑制藥物目前正處于腫瘤治療的不同臨床試驗階段。然而，這類藥物單獨用于臨床腫瘤治療的效果一般都不理想，推測原因可能是一方面臨床腫瘤異質(zhì)性很強，靶標(biāo)表達有強有弱，造成藥物敏感性不足；另一方面一種藥物長期使用易導(dǎo)致腫瘤耐藥。其中，耐藥是卵巢癌復(fù)發(fā)和治療失敗的重要原因，因此，研究卵巢癌細胞HER2和wnt/β-catenin信號通路之間的相互作用，闡明其發(fā)生相互作用的分子機制，將為揭示卵巢癌耐藥性的產(chǎn)生原因及靶向治療藥物的聯(lián)合使用提供依據(jù)，具有重要的理論與現(xiàn)實意義。

圖4 Western blot法檢測加入信號刺激劑或抑制劑對SKOV3細胞中HER2、β-catenin和TCF4表達的影響

圖5Transwell實驗(×100)、劃痕實驗(×40)檢測信號刺激劑或抑制劑對SKOV3-shHER2細胞遷移能力的影響

A：Transwell實驗；B：劃痕實驗；1：SKOV3-shHER2；2： SKOV3-shHER2+wnt3a；3：SKOV3-shHER2+EGF； 4：SKOV3+iCRT14；與SKOV3-shHER2比較：*P<0.05

EGFR家族包括HER1/EGFR/ErbB1、HER2/ErbB2/Neu、HER3/ErbB3與HER4/ErbB4，其中HER2對EGFR的活化起著至關(guān)重要的作用，盡管配體在誘導(dǎo)EGFR家族受體二聚化過程中既可以形成同二聚體也可以形成異二聚體，但是，這些受體在HER2存在的條件下都傾向于優(yōu)先與HER2形成異二聚體，從而促進腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和放化療抗性[9]。wnt信號通路主要包括wnt/β-catenin、wnt/planar cell polarity和wnt/Ca2+信號通路。其中wnt/β-catenin是經(jīng)典通路，在生物進化中極為保守，主要調(diào)控細胞的增殖和分化；已有研究[10]證實，wnt及其通路蛋白成分過度表達或者突變等原因引起該信號通路異?；罨?，使β-catenin不能被降解而在胞質(zhì)中積累，一定程度時向細胞核轉(zhuǎn)移，并與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF家族蛋白結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，從而激活cyclin D1、c-myc、MMP-7、Axin2等原癌基因，進而導(dǎo)致細胞的過度增殖與凋亡減少，細胞發(fā)生癌變。很多腫瘤細胞共表達HER2與wnt蛋白受體，并自分泌EGF與wnt等多種生長因子或可溶性蛋白，進而形成配體/受體/MAPK、PI3K與wnt信號通路之間的自分泌性正反饋激活。同時，受體下游MAPK、PI3K與wnt信號通路也可以通過某些效應(yīng)分子對自身或者對方信號通路產(chǎn)生負反饋抑制，例如MPKs、PTEN與分泌性的frizzled相關(guān)蛋白等[11-13]。同時在曲妥珠單抗(trastuzumab)抗性腫瘤細胞株中wnt3蛋白的高表達可以促進wnt/β-catenin信號通路激活[14]。

圖6Transwell實驗(×100)、劃痕實驗(×40)檢測信號刺激劑或抑制劑對SKOV3-shTCF4細胞遷移能力的影響

A：Transwell實驗；B：劃痕實驗；1：SKOV3-shTCF4；2：SKOV3-shTCF4+wnt3a；3：SKOV3- shTCF4+EGF；4：SKOV3+iCRT14；與SKOV3-shTCF4比較：*P<0.05

由于TCF4和β-catenin是wnt信號通路的兩個關(guān)鍵性節(jié)點分子，因此本實驗主要通過HER2、TCF4和β-catenin來研究HER2和wnt/β-catenin信號通路是否存在相互作用。首先構(gòu)建了SKOV3-shHER2和SKOV3-shTCF4細胞株，使用Western blot驗證敲低效果，敲低成功后，同時采用Transwell實驗和劃痕實驗檢測敲低前后細胞遷移能力的變化，結(jié)果表明敲低HER2和TCF4后，均引起SKOV3細胞遷移能力的降低。同時Western blot實驗顯示敲低HER2，TCF4和β-catenin的表達會降低，而敲低TCF4，HER2的表達也同樣降低。結(jié)果提示HER2的表達和TCF4的表達相關(guān)。為了進一步研究HER2和TCF4之間的作用，分別使用了wnt3a和EGF以及wnt信號通路的小分子抑制劑iCRT14分別刺激SKOV3細胞，Western blot結(jié)果表明加入EGF后HER2的表達量會隨著刺激時間的延長而增高，同時TCF4和β-catenin的表達也隨之明顯增高；加入wnt3a后TCF4和β-catenin的表達量會隨著刺激時間的延長而增高，同時HER2的表達也隨之明顯增高；加入iCRT1后TCF4和β-catenin的表達量會隨著刺激時間的延長而減少，同時HER2的表達也明顯降低。在加入小分子抑制劑iCRT14 12 h后，HER2和TCF4的表達相比之前有所增加，考慮是iCRT14作用效果消失。Western blot的結(jié)果表明HER2和wnt/β-catenin信號通路存在相互作用。為了驗證這一結(jié)果，又采用Transwell和劃痕實驗檢測分別在SKOV3-shHER2和 SKOV3-shTCF4細胞加入EGF和wnt3a后，細胞遷移能力的變化。同時和在SKOV3加入iCRT14進行比較。結(jié)果表明，SKOV3-shHER2細胞在加入wnt3a后，細胞遷移能力明顯上升；SKOV3-shTCF4細胞在加入EGF后，細胞遷移能力明顯上升。在SKOV3加入iCRT14后，細胞遷移能力明顯降低，考慮是iCRT14濃度(25 nmol/L)過高。以上結(jié)果差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，在卵巢癌SKOV3細胞中，存在著HER2和wnt/β-catenin信號通路的相互作用，并促進了卵巢癌細胞的轉(zhuǎn)移，可以為卵巢癌耐藥性的產(chǎn)生原因及靶向治療藥物的聯(lián)合使用提供依據(jù)。但關(guān)于HER2和wnt/β-catenin信號通路進行相互作用的具體機制和作用靶點需要進一步研究。

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