孫美濤，自加吉，陳 瑩，嚴(yán)長(zhǎng)寶，戴莉萍，余 敏，熊 偉*

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)第三附屬醫(yī)院病理科，云南大理 671000；3.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 530061）

胃癌是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率高、轉(zhuǎn)移率高和死亡率高等特點(diǎn)〔1〕。我國(guó)是胃癌高發(fā)區(qū)，發(fā)病率以中老年居多，目前有低齡化趨勢(shì)，給家庭和社會(huì)帶來(lái)極大危害〔2〕。胃癌的發(fā)生是多基因多階段參與的涉及多種環(huán)境因素及遺傳因素長(zhǎng)期的相互作用〔3〕。因此，進(jìn)行胃癌的病因?qū)W研究，對(duì)胃癌進(jìn)行有效的病因預(yù)防，具有十分重要的意義。

缺氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia-inducible factors，HIF）是介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)缺氧微環(huán)境進(jìn)行適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子〔4〕。HIF-1α基因首先是由Semenza等在低氧處理肝癌細(xì)胞株Hep3B時(shí)發(fā)現(xiàn)的，第一個(gè)被證實(shí)的HIF-1α靶基因是人類促紅細(xì)胞生成素（Human erythropoietin，HuEPO）基因。在細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境和腫瘤發(fā)展的過(guò)程中HIF-1α扮演著重要的角色〔5〕。HIF-1α基因定位于人類第14q23.2，含有16個(gè)外顯子，存在3個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本，其完整的轉(zhuǎn)錄本2（NM_001530.3）的全長(zhǎng)cDNA為4 082 bp，編碼的蛋白質(zhì)由826個(gè)氨基酸殘基組成。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1是由氧調(diào)節(jié)的α亞基和組成性表達(dá)的β亞基構(gòu)成的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子。其中HIF-1α亞基是感受氧和介導(dǎo)生理性或病理性缺氧反應(yīng)的關(guān)鍵因子〔6〕。HIF-1作為低氧條件下最重要的調(diào)控因子，參與細(xì)胞多種缺氧反應(yīng)。在缺氧的條件下，HIF-1α的表達(dá)水平增高，是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧代謝的關(guān)鍵因子之一，可以調(diào)節(jié)包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1在內(nèi)的眾多靶基因的表達(dá)。同時(shí)HIF-1α在能量代謝和細(xì)胞增殖等方面也起到重要的作用〔7-9〕。本研究基于Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)、癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)以及Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，進(jìn)而分析HIF-1α基因在胃癌中的表達(dá)水平及其預(yù)后意義，為闡明HIF-1α基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析HIF-1α在胃癌的基因表達(dá)Oncomine v4.5數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)基于基因芯片的數(shù)據(jù)庫(kù)和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)，在此數(shù)據(jù)庫(kù)中可根據(jù)自己的需要設(shè)定篩選條件。本研究中設(shè)定的篩選條件為：①“Gene：HIF-1α（200989_at）”；②“Analysis type：cancer vs.normal analysis”；③“Cancer type：gastric cancer”；④“Date type：mRNA”；⑤“Sample type：clinical specimen”；⑥ 臨界值設(shè)定條件（P value＜0.0001，fold change＞2.0，gene rank=top 10%）。通過(guò)以上設(shè)定因素分析HIF-1α基因在胃癌中的表達(dá)。

1.2 利用cBioportal工具分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HIF-1α在胃癌的突變利用cBioportal（www.cbioportal.org）在線工具，在數(shù)據(jù)庫(kù)類型中選擇“TCGA database”，腫瘤類型選擇“Stomach adenocarinoma”，數(shù)據(jù)類型選擇“Mutation and CNA”，基因選擇“HIF-1α”，分析HIF-1α在胃癌的突變情況。

1.3 利用Kaplan-MeierPlotter進(jìn)行患者生存周期分析利用 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)（ http：∕∕kmplot.com∕analysis∕）的胃癌數(shù)據(jù)集進(jìn)行在線生存分析。篩選條件如下：①“Cancer：gastric cancer”；②“Gene：HIF-1α”；③“Survival：overall survival”；④“Lauren classification：all∕intestinal∕diffuse∕mixed”。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析正常胃和胃癌組織之間HIF-1α表達(dá)的差異采用t檢驗(yàn)。HIF-1α基因表達(dá)與患者生存期的關(guān)系采用Kaplan-Meier模型進(jìn)行生存分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α在所有腫瘤類型中的表達(dá)Oncomine v4.5數(shù)據(jù)庫(kù)中共收集了998個(gè)不同類型的研究結(jié)果，其中關(guān)于HIF-1α表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的研究結(jié)果共142個(gè)，HIF-1α表達(dá)增高的研究有36個(gè)，HIF-1α表達(dá)降低的研究有106個(gè)。見(jiàn)圖1。在人類消化道系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤中，食管癌中高表達(dá)的研究有1個(gè)，低表達(dá)的研究有2個(gè)；胃癌中高表達(dá)的研究有2個(gè)，低表達(dá)的研究有2個(gè)；肝癌中高表達(dá)的研究有2個(gè)；結(jié)直腸癌中高表達(dá)的研究有1個(gè)，低表達(dá)的研究有8個(gè)。見(jiàn)表1。

表1 HIF-1α基因在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中所有腫瘤相關(guān)研究中的表達(dá)

2.2 HIF-1α在胃癌中的表達(dá)結(jié)果Oncomine v4.5數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索發(fā)現(xiàn)，從2003年開(kāi)始，共有12項(xiàng)研究涉及HIF-1α在胃癌和正常組織中的表達(dá)，共包括798個(gè)樣本。文章分別發(fā)表于Mol Biol Cell〔10〕、Clin Cancer Research〔11〕、Nucleic Acids Research〔12〕、Eur J Cancer〔13〕、Med Oncol〔14〕。薈萃分析 12 項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常胃組織相比，HIF-1α在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，中位數(shù)值為701.5，P=0.000 216，表明其高表達(dá)且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 HIF-1α在不同類型胃癌組織和正常胃組織的表達(dá)差異在Oncomine v4.5數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果顯示，相比正常胃組織，HIF-1α基因在胃癌、彌漫型胃癌、腸型胃癌和混合型胃癌中均呈現(xiàn)高表達(dá)。見(jiàn)圖1。

圖1 Oncomine芯片數(shù)據(jù)庫(kù)中HIF-1α在不同胃癌組織中的表達(dá)情況

2.4 HIF-1α在胃癌的突變分析利用cBioportal在線工具分析發(fā)現(xiàn)，HIF-1α由826個(gè)氨基酸組成，包含PAS、PAS-3和HIF 3種不同的結(jié)構(gòu)域。HIF-1α在胃癌中的突變有錯(cuò)義突變、框移突變和剪接突變3種類型。其中錯(cuò)義突變包括477位的賴氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸（K477T）、690位的氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼幔╒690M）、694位的丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸（A694T）、795位的亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦彼幔↙795P）?？蛞仆蛔?yōu)?13位的天冬酰胺到619位的丙氨酸發(fā)生了缺失（N613_A619del）。剪接突變?yōu)榈?53位氨基酸對(duì)應(yīng)的mRNA發(fā)生了剪接錯(cuò)誤。見(jiàn)圖2。

圖2 HIF-1α在胃癌中的突變情況

2.5 HIF-1α表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系為進(jìn)一步明確HIF-1α表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后之間的關(guān)系，本研究在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中提取HIF-1α基因表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后相關(guān)的數(shù)據(jù)，通過(guò)Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)：與HIF-1α高表達(dá)組相比，HIF-1α低表達(dá)組胃癌患者的累積存活時(shí)間縮短（HR=0.73，P=0.000 36）。在腸型胃癌患者中，HIF-1α高表達(dá)胃癌患者的存活時(shí)間延長(zhǎng)（HR=0.54，P=0.000 13）。在彌漫型胃癌患者中，HIF-1α高表達(dá)胃癌患者的存活時(shí)間延長(zhǎng)（HR=0.57，P=0.001 20）。在混合型胃癌患者中，HIF-1α高表達(dá)胃癌患者的存活時(shí)間延長(zhǎng)（HR=0.33，P=0.038 00）。見(jiàn)圖3。以上結(jié)果提示，在不同類型的胃癌中，HIF-1α基因表達(dá)水平越高，患者的存活時(shí)間越長(zhǎng)。

3 討論

胃癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制涉及一系列遺傳學(xué)改變，包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活，胃癌的發(fā)生演變涉及到多種環(huán)境因素及遺傳因素長(zhǎng)期的相互作用〔15〕。HIF-1α是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)高度特異性在缺氧狀態(tài)下可以發(fā)揮活性的核轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動(dòng)物組織中廣泛存在，組織在處于缺氧狀態(tài)時(shí)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄和調(diào)控作用〔16〕。有研究認(rèn)為，HIF-1α在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及腫瘤的轉(zhuǎn)移中起著核心功能。HIF-1α可防止腫瘤細(xì)胞凋亡，其高表達(dá)使腫瘤細(xì)胞耐缺氧的能力得到增強(qiáng)。研究表明，HIF-1α在評(píng)價(jià)腫瘤治療及預(yù)后中發(fā)揮重要的作用〔17〕。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究顯示結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌等腫瘤中HIF-1α的表達(dá)顯著增強(qiáng)，在一些癌前病變組織中也可以檢測(cè)到HIF-1α的存在，而在正常組織中則無(wú)表達(dá)〔18〕。

圖3 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析HIF-1α對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響

Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)是目前世界上最大的基因芯片數(shù)據(jù)和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)，本研究利用該數(shù)據(jù)平臺(tái)避免了因?yàn)闃颖玖康膯?wèn)題導(dǎo)致的誤差，增加了結(jié)論的可信度〔19〕。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)是最大的一個(gè)癌癥基因信息數(shù)據(jù)庫(kù)，為腫瘤醫(yī)學(xué)研究者提供了海量的基因組數(shù)據(jù)和與其關(guān)聯(lián)的臨床數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步挖掘有意義的基因組變化和發(fā)現(xiàn)影響腫瘤發(fā)展、分化等分子機(jī)制提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)〔20〕。在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)提取HIF-1α基因mRNA在胃癌及正常組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示人HIF-1α基因mRNA表達(dá)在胃癌組織中高于正常組織，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 216）。

The Kaplan Meier plotter（http：∕∕kmplot.com ∕analysis∕）是目前世界上最廣為接受的一個(gè)預(yù)后相關(guān)在線分析數(shù)據(jù)庫(kù)，涵蓋了10 188例腫瘤樣本（4 142例乳腺癌樣本，1648例卵巢癌樣本，2437例肺癌樣本和1 065例胃癌樣本），可對(duì)54 675個(gè)基因進(jìn)行相關(guān)預(yù)后分析，并得出真實(shí)可信客觀的結(jié)果〔21〕。通過(guò)在Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)，與HIF-1α高表達(dá)組相比，HIF-1α高表達(dá)組胃癌患者的累積生存時(shí)間延長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在腸型胃癌患者中，HIF-1α高表達(dá)組胃癌患者的存活時(shí)間延長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在彌漫型胃癌患者中，HIF-1α高表達(dá)組胃癌患者的存活時(shí)間延長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在混合型胃癌患者中，HIF-1α高表達(dá)組患者的存活時(shí)間延長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明不同類型的胃癌中，HIF-1α基因表達(dá)水平增高，是胃癌患者預(yù)后的保護(hù)因素。

通過(guò)公開(kāi)平臺(tái)基因芯片數(shù)據(jù)分析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，較傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法有花費(fèi)少、數(shù)據(jù)量大的特點(diǎn)，但數(shù)據(jù)信息多為基因mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)，所以還需要進(jìn)行蛋白質(zhì)水平的驗(yàn)證。但是通過(guò)基因芯片的數(shù)據(jù)分析，可以對(duì)課題可行性進(jìn)行初步的探索，預(yù)測(cè)結(jié)果并提供理論證據(jù)。本研究中發(fā)現(xiàn)HIF-1α的表達(dá)水平與胃癌患者的累計(jì)生存期有明顯的相關(guān)性，為下一步免疫組化驗(yàn)證提供了參考。綜上所述，通過(guò)利用上述3大數(shù)據(jù)庫(kù)的深入挖掘，發(fā)現(xiàn)HIF-1α在胃癌中高表達(dá)，且與胃癌患者的預(yù)后有強(qiáng)相關(guān)性，HIF-1α高表達(dá)是胃癌患者預(yù)后的保護(hù)因素。以上結(jié)果將為胃癌的臨床基因治療和新型抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)提供潛在的靶標(biāo)。

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