羅丹丹，方海蘭，李 楊，段寶忠

（大理大學藥學與化學學院，云南大理 671000）

防風為常用中藥，來源于傘形科防風屬植物防風 Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk.的根，具有祛風解表，勝濕止痛，止痙功效〔1〕。各地常將川防風Ligusticum brachylobum Franch.、竹葉防風Seseli mairei H.Wolff、松葉防風S.yunnanense Franch.以及同科多種植物如杏葉防風Pimpinella candolleana Wight&Arn.、石 防 風 Peucedanum terebinthaceum（Fisch.ex Trevir.）Ledeb.、葛縷子 Carum carvi L.等作為防風混偽品使用〔2-5〕，由于這些藥材均來源于傘形科，其根部特征與防風較為相似，采用傳統(tǒng)的性狀和顯微鑒別等方法難以鑒別〔6-8〕，對臨床用藥安全造成極大威脅。

DNA條形碼（DNA barcoding）技術是分子鑒定的最新發(fā)展，即通過比較一段通用DNA片段，對物種進行快速、準確的識別和鑒定〔9〕。陳士林等對大量樣本的研究表明，ITS2序列是鑒定藥用植物及其混偽品的理想條形碼〔10〕。該技術已廣泛用于重樓〔11〕、臭牡丹〔12〕、艾葉〔13〕、何首烏〔14〕等多種中藥材的混偽品鑒別研究，并取得了良好的效果。目前已有學者采用ITS2條形碼對防風及其偽品中華前胡和杏葉防風等開展了鑒別研究，結果表明DNA條形碼技術可有效鑒別防風及其混偽品〔15〕，但未見該技術用于竹葉防風、松葉防風等常見偽品的分子鑒別研究。鑒于此，本研究在建立防風及其常見混偽品的參照DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的基礎上，對來源于市場的28批標簽為防風的藥材進行了研究，以期為DNA條形碼技術在藥品檢驗和市場監(jiān)管領域的應用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器PCR儀（2720，Applied Biosystems，USA）；1-14K型高速冷凍離心機（Sigma公司）；植物組織研磨儀（Retsch MM400）；NanoDrop 2000∕2000C分光光度計（Thermo Fisher Scientific公司）；各種量程的微量移液器（Eppendorf）。

1.2 材料本研究采集包括防風Saposhnikovia divaricata、竹葉防風Seseli mairei、杏葉防風Pimpinella candolleana及華山前胡Peucedanum ledebourielloides等4個物種8份植物樣本，經(jīng)大理大學段寶忠副教授鑒定，并從GenBank下載防風常見偽品的ITS2序列16條，含上述8個物種共24條ITS2序列用于構建防風及其混偽品的標準條形碼數(shù)據(jù)庫。見表1。28批標簽為防風的藥材（HSM-01～28）收集于市場或委托藥商購于市場，其基原不詳。見表2。

表1 防風及其習用品ITS2序列信息表

表2 市場收集藥材樣品表

2 方法

2.1 DNA提取植物樣本葉片采用硅膠進行干燥，取30 mg，市場購買藥材切碎，取40 mg。用植物組織研磨儀（Retsch MM400，Germany）研磨2 min?？侱NA提取在植物組織提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，China）的操作規(guī)程基礎上進行了改進。研磨后，使用核分離緩沖液（100 mmol∕L Tris-HCl，pH 8.0；20 mmol∕L EDTA，pH 8.0；0.3 mmol∕L NaCl；2%PVP40；2%β-巰基乙醇）抽提2次；水浴溫度為54℃，水浴時間6 h；水浴后，使用氯仿-異戊醇（24∶1）抽提2次。其他操作均按試劑盒規(guī)程。

2.2 PCR擴增及測序ITS2序列的反應條件，擴增引物，以及擴增程序參照文獻進行〔16〕。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，有條帶的PCR產物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行雙向測序。

2.3 數(shù)據(jù)處理所得的測序峰圖利用CodonCode Aligner Version 5.1.5（CodonCode Co.，USA）進行組裝拼接?；陔[馬爾夫模型的HMMer注釋方法將所得序列及GenBank序列，除去5.8S和28S區(qū)，獲得ITS2序列。采用MEGA 6.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）構 建 NJ（Neighbor-Joining）樹，Kimura 2-Parameter（K2P）法計算遺傳距離。

3 結果

3.1 DNA提取與PCR擴增效率PCR擴增效率及測序成功率是評價DNA條形碼序列的兩個重要指標。本研究中，所提取的36份樣品DNA（包括8份植物樣本和28份藥材樣本），經(jīng)NanoDrop 2000測定，A260∕A280值為1.8 ～ 2.0之間，樣品DNA濃度為100～300 ng∕μL。表明改進后的提取方法所提取的DNA質量較好。PCR擴增效率及測序成功率均為100%。

3.2 參考樣本ITS2序列遺傳距離用于構建標準數(shù)據(jù)庫的24條ITS2序列（8條植物樣本序列，16條GenBank下載序列）長度范圍為221～229 bp，GC含量為51.80%～59.26%。防風種內5個樣本間的K2P遺傳距離為0.000，防風與其他物種間的K2P距離范圍為0.037～0.307。防風種內遺傳距離小于種間遺傳距離，表明ITS2序列可用于防風及其混偽品的鑒別。

3.3 市場藥材鑒定分析將28批標簽為防風的藥材（編號HSM-01～28），分別在NCBI數(shù)據(jù)庫（https：∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕）、中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)（TCM-DBS，http：∕∕.tcmbarcode.cn∕china∕）進行相似性搜索，DNA條形碼比對結果見表3。從表3可看出，28批藥材樣品分屬于5個物種，其中有10份藥材為防風，占35.71%；8份與竹葉防風具有高度相似性，占28.57%；6份與華山前胡相似，占21.43%；3份與杏葉防風相似，占10.71%；1份為傘形科其他物種。

表3 市售標簽為防風的藥材BLAST及TCM-DBS鑒定結果

3.4 市場藥材NJ樹分析將市場28個藥材樣品的ITS2序列與24條參考DNA條形碼，構建NJ樹。見圖1。從圖1可看出，樣品HSM-02～04、06～12與正品防風S.divaricata聚為一支；樣品HSM-01、05、20～24、26與竹葉防風 S.mairei聚為一支；樣品HSM-13～18與華山前胡 P.ledebourielloides聚為一支；樣品HSM-19和HSM-27～28與杏葉防風P.candolleana聚為一支。僅HSM-25未與參考序列庫內的物種聚為一支，BLAST結果為白花前胡P.praeruptorum或紅前胡P.rubricaule。

4 討論與結論

藥材基原物種的準確鑒定是避免混偽品混淆使用的關鍵。傳統(tǒng)的性狀和顯微鑒定方法主要依靠形態(tài)特征進行鑒定，這類方法主觀性強，同時對鑒定者的專業(yè)水平要求高。隨著當前傳統(tǒng)鑒定專業(yè)人才的匱乏，藥材外觀相似或同物異名對市場藥材監(jiān)管部門提出了挑戰(zhàn)。DNA條形碼是一種分子鑒定技術，其不受環(huán)境因素、樣品形態(tài)和材料部位的限制，已成為中藥原植物和藥材鑒定的有效手段〔9〕，其操作簡單，可實現(xiàn)鑒定結果的客觀和自動化，有效緩解了中藥材鑒定人才缺乏的現(xiàn)狀。

圖1 基于ITS2序列構建的防風市場藥材NJ樹

本研究采用ITS2條形碼鑒定防風常見混偽品〔17-18〕，建立了防風及其混偽品的參考DNA標準條形碼數(shù)據(jù)庫，并利用該數(shù)據(jù)庫對市場收集的28批標簽為“防風”的藥材進行了鑒定和驗證。結果表明ITS2序列可有效鑒別已知混偽品。DNA鑒定結果表明，市售防風藥材來源復雜，在調查的28批防風藥材中，僅有10批為正品防風S.divaricata，其余藥材植物基原可能有竹葉防風S.mairei，華山前胡P.ledebourielloides，白花前胡P.praeruptorum、杏葉防風P.candolleana等多種，這些藥材性味功效與防風差異較大〔19〕，對防風臨床用藥的安全和有效造成了極大威脅。上述DNA條形碼的鑒定結果與前人的研究結果基本一致〔3〕，表明DNA條形碼可作為中草藥來源鑒定和市場混偽品檢測的有效工具。

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