吳 杰 鄧 波 李孝輝 徐子偉*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，植物保護(hù)與微生物研究所，杭州 310021)

畜禽生產(chǎn)中由于斷奶等應(yīng)激會(huì)引起腸道炎癥及腸道屏障功能損傷，造成動(dòng)物腹瀉、消化功能紊亂。益生菌是一類對宿主有益的活性微生物，其能夠定植于宿主體內(nèi)，改善宿主腸道微生態(tài)平衡，發(fā)揮有益作用。在動(dòng)物生產(chǎn)中益生菌常作為生長促進(jìn)劑，可幫助畜禽建立和完善腸道微生物區(qū)系，提高飼料報(bào)酬，改善機(jī)體免疫力，提高畜產(chǎn)品質(zhì)量，是一種較有潛力的抗生素替代品[1-2]。益生菌種類有很多，不同益生菌的功效有所差異。丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)是一種厭氧的革蘭氏陽性芽孢桿菌，相較于其他益生菌，其主要以內(nèi)生孢子形式存在，易貯藏且具有較好的抗逆性。研究表明丁酸梭菌能產(chǎn)生多種消化酶、維生素、丁酸等營養(yǎng)物質(zhì)，具有較好的腸道營養(yǎng)功能[3]。此外，丁酸梭菌的代謝產(chǎn)物含有丁酸、乙酸、氫氣等，能夠降低腸道炎癥，加速腸道損傷修復(fù)[4-5]，對斷奶引起的腹瀉、腸道損傷、腸道菌群紊亂有較好的應(yīng)用前景，已于2009年7月被農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)為新一代微生態(tài)飼料添加劑。目前丁酸梭菌在生產(chǎn)上的使用都是預(yù)防性添加在飼糧中，但預(yù)防性飼喂丁酸梭菌對健康機(jī)體急性應(yīng)激致?lián)p時(shí)的應(yīng)用效果目前研究的還不多，預(yù)防性添加能否幫助健康宿主緩解急性應(yīng)激損傷還值得進(jìn)一步研究確認(rèn)。因此，本試驗(yàn)以大鼠為研究對象，研究預(yù)防性飼喂丁酸梭菌對健康大鼠生長性能及脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)致急性應(yīng)激大鼠腸道結(jié)構(gòu)、腸道二糖酶活性及腸道炎癥的修復(fù)效果，以期為預(yù)防性添加丁酸梭菌緩解動(dòng)物急性應(yīng)激損傷研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與材料

丁酸梭菌制劑由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物微生物研究所提供，活菌數(shù)為4×109CFU/g。

體重為120 g左右的雄性SD試驗(yàn)大鼠36只，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院；基礎(chǔ)飼糧為維持鼠糧，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

將36只SD大鼠按體重隨機(jī)分為對照組、LPS組、LPS+丁酸梭菌組，每4只大鼠1籠，每組3籠。室溫控制在25 ℃，每3 d更換1次墊料，保持鼠籠清潔干燥，所有大鼠均自由飲水、自由采食。預(yù)飼3 d后開始試驗(yàn)，對照組和LPS組大鼠飼喂基礎(chǔ)飼糧，LPS+丁酸梭菌組大鼠在基礎(chǔ)飼糧基礎(chǔ)上添加0.05%的丁酸梭菌，每5 d稱重并記錄采食量。試驗(yàn)第40天，所有大鼠稱重后，LPS組與LPS+丁酸梭菌組大鼠按照4 mg/kg BW的劑量腹腔注射1 mL左右濃度為1.5 mg/mL的LPS，對照組腹腔注射1 mL生理鹽水，3 h后處死所有大鼠并采集小腸。

1.3 樣品采集與檢測指標(biāo)

各組大鼠斷頸處死，剖開腹腔，分離腸道組織，剪取十二指腸、空腸、回腸組織各2份。一份腸道組織用4%多聚甲醛固定過夜后，石蠟包埋，連續(xù)切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，封固，拍照(Olympus DP-71拍攝系統(tǒng))，采用Image-ProPlus 5.0系統(tǒng)采集、測量并統(tǒng)計(jì)絨毛高度、隱窩深度、黏膜厚度、上皮淋巴細(xì)胞(intraepithelial lymphocyte，IEL)數(shù)，計(jì)算絨隱比(V/C，絨隱比=絨毛高度/隱窩深度)。上皮淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)方法如下：每個(gè)標(biāo)本觀察3～6個(gè)絨毛，計(jì)數(shù)每個(gè)絨毛上皮層內(nèi)每100個(gè)柱狀上皮細(xì)胞間淋巴細(xì)胞數(shù)，再換算成百分比(%)，最后取平均值代表該標(biāo)本的上皮淋巴細(xì)胞數(shù)。另一份腸道組織置于離心管中，液氮速凍后-80 ℃保存待測。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)維生素預(yù)混料為每千克飼糧提供The vitamin premix provided the following per kg of the diet：VA 4 000 IU，VD 1 000 IU，VE 75 IU，VK 0.9 mg，VB15 mg，VB26 mg，VB330 mg，VB515 mg，VB66 mg，膽堿 choline 1 000 mg，葉酸 folic acid 2 mg，生物素 biotin 0.2 mg，VB120.025 mg。

2)礦物質(zhì)預(yù)混料為每千克飼糧提供The mineral premix provided the following per kg of the diet：Ca 5 000 mg，P 3 000 mg，K 3 600 mg，Na 1 039 mg，Mg 513 mg，F(xiàn)e 45 mg，Zn 38 mg，Mn 10 mg，Cu 6 mg，I 0.2 mg，Cr 1 mg，S 300 mg，Cl 1 631 mg。

腸道總蛋白含量以及髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、蔗糖酶、乳糖酶、麥芽糖酶活性采用比色法測定，白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)含量采用酶聯(lián)免疫吸附法測定，上述指標(biāo)測定所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用LSD法多重比較檢測組間的差異顯著性。以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸梭菌對健康大鼠生長性能的影響

由表2可知，所有大鼠體重變化基本一致，丁酸梭菌對大鼠平均日采食量、平均日增重及料重比均無顯著影響(P>0.05)。

表2 丁酸梭菌對健康大鼠生長性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或者無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant different (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 丁酸梭菌對LPS處理大鼠腸道結(jié)構(gòu)及上皮淋巴細(xì)胞數(shù)的影響

由表3可知，與對照組相比，LPS組大鼠注射LPS后十二指腸隱窩深度顯著增加(P<0.05)，絨隱比顯著降低(P<0.05)，但空腸、回腸黏膜絨毛結(jié)構(gòu)未見顯著破壞(P>0.05)。與LPS組相比，預(yù)防性飼喂丁酸梭菌可顯著降低十二指腸隱窩深度(P<0.05)，但并未抑制LPS對十二指腸絨隱比的降低，LPS+丁酸梭菌組十二指腸絨隱比與對照組相比仍顯著降低(P<0.05)。與對照組相比，LPS組大鼠注射LPS會(huì)顯著降低空腸黏膜厚度以及空腸、回腸上皮淋巴細(xì)胞數(shù)(P<0.05)。與LPS組相比，預(yù)防性飼喂丁酸梭菌能有效抑制LPS對黏膜厚度及上皮淋巴細(xì)胞數(shù)的影響，在空腸中的效果最為明顯，LPS+丁酸梭菌組空腸黏膜厚度及上皮淋巴細(xì)胞數(shù)較LPS組顯著提高(P<0.05)，且與對照組差異不顯著(P>0.05)。

2.3 丁酸梭菌對LPS處理大鼠腸道蔗糖酶、乳糖酶、麥芽糖酶活性的影響

由表4可知，與對照組相比，LPS組大鼠注射LPS后十二指腸蔗糖酶和空腸麥芽糖酶活性顯著降低(P<0.05)，其他腸段各二糖酶活性有降低趨勢，但差異均不顯著(P>0.05)。與LPS組相比，預(yù)防性飼喂丁酸梭菌能抑制LPS對大鼠十二指腸蔗糖酶活性的降低，使得LPS+丁酸梭菌組與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。

2.4 丁酸梭菌對LPS處理大鼠腸道炎癥的影響

由表5可知，與對照組相比，LPS組大鼠注射LPS后空腸和回腸MPO活性及IL-6、TNF-α含量顯著增加(P<0.05)。與LPS組相比，預(yù)防性飼喂丁酸梭菌能有效抑制空腸、回腸的炎癥，LPS+丁酸梭菌組空腸與回腸MPO活性以及回腸IL-6、TNF-α含量均顯著降低(P<0.05)。此外，LPS+丁酸梭菌組回腸IL-6、TNF-α含量雖較LPS組無顯著降低(P>0.05)，但較對照組也未見顯著增加(P>0.05)。

3 討 論

3.1 丁酸梭菌對健康大鼠生長性能的影響

益生菌在宿主腸道內(nèi)能調(diào)節(jié)腸道菌群，并產(chǎn)生許多有益物質(zhì)，對宿主體重起到積極作用。以高脂飼糧飼喂大鼠，在飼糧中添加乳酸桿菌能通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，并提高血液瘦素水平來降低大鼠體重，抑制肥胖[6]。而在動(dòng)物生產(chǎn)中，益生菌常作為生長促進(jìn)劑來緩解外界環(huán)境或飼料應(yīng)激對動(dòng)物造成的影響。Meng等[7]發(fā)現(xiàn)添加枯草芽孢桿菌和丁酸梭菌能有效提高生長肥育豬全期的平均日增重及料重比，同時(shí)總能和氮的表觀消化率也顯著提高。Cao等[8]發(fā)現(xiàn)在肉雞飼糧中添加2.5×107或5.0×107CFU/kg丁酸梭菌均能顯著提高其21及42日齡的平均日增重及料重比，并且效果與添加抗生素組一致。然而益生菌對體重的影

響并不總是效果顯著，Kuo等[9]在為期3～4周的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，益生菌對健康小鼠體重及采食量的影響十分有限，結(jié)果與本研究一致。本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂丁酸梭菌對健康大鼠包括平均日增重、料重比在內(nèi)的生長指標(biāo)均無顯著影響，這可能和動(dòng)物健康狀態(tài)及生活環(huán)境有關(guān)，本試驗(yàn)使用的大鼠正處生長階段，其正常生長速度較快，并且鼠籠環(huán)境清潔，衛(wèi)生狀況良好，這些都可能掩蓋了益生菌對動(dòng)物機(jī)體生長促進(jìn)作用。

表3 丁酸梭菌對LPS處理大鼠腸道結(jié)構(gòu)及上皮淋巴細(xì)胞數(shù)的影響

表4 丁酸梭菌對LPS處理大鼠腸道二糖酶活性的影響

續(xù)表4項(xiàng)目Items對照組ControlgroupLPS組LPSgroupLPS+丁酸梭菌組LPS+Clostridiumbutyricumgroup回腸Ileum蔗糖酶Sucrase5.33±0.134.64±1.035.85±0.86乳糖酶Lactase5.41±2.844.87±1.776.70±0.60麥芽糖酶Maltase14.87±0.4115.27±5.4715.63±3.07

表5 丁酸梭菌對LPS處理大鼠腸道MPO、IL-6、TNF-α含量的影響

3.2 丁酸梭菌對LPS處理大鼠腸道結(jié)構(gòu)及上皮淋巴細(xì)胞數(shù)的影響

腸道的絨毛高度、隱窩深度、絨隱比及黏膜厚度是反映腸道發(fā)育狀況及營養(yǎng)吸收的重要指標(biāo)。王騰浩[10]研究表明，丁酸梭菌ZJU-F1可以抑制斷奶應(yīng)激對十二指腸、空腸和回腸絨毛高度及絨隱比的降低，在光鏡下，飼喂丁酸梭菌的仔豬微絨毛結(jié)構(gòu)更加整齊致密。劉亭婷[11]也得到相似結(jié)果，在肉雞飼糧中添加1 000 mg/kg丁酸梭菌能顯著提高十二指腸、空腸、回腸的絨毛高度及絨隱比，增加空腸黏膜厚度。本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂丁酸梭菌能有效降低十二指腸隱窩深度，增加空腸黏膜厚度，結(jié)果與之前研究一致。丁酸梭菌的這種腸道營養(yǎng)功能可能與其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物有關(guān)。丁酸梭菌在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生糖苷酶、纖維素酶、維生素、丁酸等，這些物質(zhì)特別是丁酸能為腸道黏膜細(xì)胞供能，加速其增殖、成熟[3,12]。

上皮淋巴細(xì)胞分布在腸道黏膜上皮細(xì)胞間，是腸道的第1道免疫屏障，它直接參與腸黏膜免疫反應(yīng)，抵抗腸道病原體入侵，并且能通過偽足與上皮細(xì)胞接觸，加速上皮細(xì)胞的再生[13]，上皮淋巴細(xì)胞數(shù)的增加有助于提高機(jī)體的免疫能力[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠飼糧中添加丁酸梭菌40 d后，LPS+丁酸梭菌組空腸上皮淋巴細(xì)胞數(shù)較LPS組顯著提高，達(dá)到對照組水平，結(jié)果與之前研究結(jié)果相一致。Rieger等[15]在斷奶仔豬中發(fā)現(xiàn)飼喂糞球桿菌能顯著提高上皮內(nèi)頂端及核位置處的上皮淋巴細(xì)胞數(shù)。Bai等[16]在肉雞的試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.1%或0.2%的益生菌能顯著提高21及42日齡時(shí)腸道上皮淋巴細(xì)胞數(shù)，特別是T淋巴細(xì)胞數(shù)。以上結(jié)果表明飼喂丁酸梭菌等益生菌能提高動(dòng)物機(jī)體腸道黏膜免疫水平，特別是細(xì)胞免疫水平。

3.3 丁酸梭菌對LPS處理大鼠腸道二糖酶活性的影響

動(dòng)物主要的能量來源于碳水化合物，而碳水化合物的消化吸收主要依賴于小腸中的二糖酶，二糖酶活性可用于衡量腸道黏膜上皮細(xì)胞發(fā)育情況[17]。竇茂鑫[18]研究表明，飼糧中添加6×106CFU/g的乳酸桿菌能有效緩解LPS刺激導(dǎo)致的空腸、回腸乳糖酶活性的降低。在鞭毛蟲感染的小鼠中也發(fā)現(xiàn)，在鞭毛蟲感染前或感染同時(shí)給予乳酸桿菌能顯著提高腸道蔗糖和乳糖酶活性[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂丁酸梭菌對大鼠腸道蔗糖、乳糖酶活性有提高的趨勢。

3.4 丁酸梭菌對LPS處理大鼠腸道炎癥的影響

TNF-α、IL-6是重要的炎癥介質(zhì)，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，其含量的增加會(huì)引起其他炎癥因子瀑布式的釋放而引發(fā)細(xì)胞損傷[20-21]。MPO是一種由中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌的血紅素蛋白酶，其活性的高低可以反映腸道炎癥浸潤程度。本研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)防性飼喂丁酸梭菌能有效降低空腸與回腸MPO活性及空腸IL-6、TNF-α含量，回腸IL-6、TNF-α含量較對照組也未見顯著降低，結(jié)果表明丁酸梭菌能有效抑制LPS引起的腸道炎癥，結(jié)果與前人研究相一致。Zhang等[22]在結(jié)腸炎模型大鼠中發(fā)現(xiàn)，每日灌胃2 mL丁酸梭菌(2.3×1011CFU/L)21 d能有效降低血液中白細(xì)胞介素-23(IL-23)和TNF-α含量，抑制唑酮引起的結(jié)腸炎癥。龐敏等[23]也發(fā)現(xiàn)灌服丁酸梭菌8 d能有效抑制腹瀉大鼠血清中內(nèi)毒素及D-乳酸的含量，降低回腸白細(xì)胞介素-10(IL-10)mRNA的表達(dá)。丁酸梭菌的這種抗炎效果主要是通過其代謝產(chǎn)物丁酸和氫來發(fā)揮作用的。研究表明丁酸能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖，加速損傷修復(fù)，降低炎癥[4]，而氫最近也被發(fā)現(xiàn)能夠作為一種抗炎氣體來緩解機(jī)體氧化應(yīng)激，治療多種炎癥疾病[5,24]。此外，丁酸梭菌還能通過Toll樣受體2(TLR2)/髓樣分化因子88(MyD88)信號通路刺激炎癥部位附近的巨噬細(xì)胞聚集，并激活I(lǐng)L-10的釋放，抑制炎性因子的生成[25]。

4 結(jié) 論

① 在本試驗(yàn)條件下，飼糧中添加0.05%丁酸梭菌對健康大鼠生長性能無顯著影響。

② 大鼠飼糧中預(yù)防性添加丁酸梭菌能抑制LPS對腸道蔗糖酶活性的降低，緩解LPS對腸道絨毛高度和隱窩深度的影響，提高腸道免疫功能，降低腸道炎癥。

參考文獻(xiàn)：

[1] ROSS G R,GUSILS C,OLISZEWSKI R,et al.Effects of probiotic administration in swine[J].Journal of Bioscience & Bioengineering,2010,109(6):545-549.

[2] GIANG H H,VIET T Q,OGLE B,et al.Growth performance,digestibility,gut environment and health status in weaned piglets fed a diet supplemented with a complex of lactic acid bacteria alone or in combination withBacillussubtilisandSaccharomycesboulardii[J].Livestock Science,2012,143(2/3):132-141.

[3] ARAKI Y,ANDOH A,FUJIYAMA Y,et al.Oral administration of a product derived fromClostridiumbutyricumin rats[J].International Journal of Molecular Medicine,2002,9(1):53-57.

[4] OKAMOTO T,SASAKI M,TSUJIKAWA T,et al.Preventive efficacy of butyrate enemas and oral administration ofClostridiumbutyricumM588 in dextran sodium sulfate-induced colitis in rats[J].Journal of Gastroenterology,2000,35(5):341-346.

[5] BUCHHOLZ B M,KACZOROWSKI D J,SUGIMOTO R,et al.Hydrogen inhalation ameliorates oxidative stress in transplantation induced intestinal graft injury[J].American Journal of Transplantation,2008,8(10):2015-2024.

[6] KANG J H,YUN S I,PARK M H,et al.Anti-obesity effect ofLactobacillusgasseriBNR17 in high-sucrose diet-induced obese mice[J].PLoS One,2012,8(1):e54617.

[7] MENG Q W,YAN L,AO X,et al.Influence of probiotics in different energy and nutrient density diets on growth performance,nutrient digestibility,meat quality,and blood characteristics in growing-finishing pigs[J].Journal of Animal Science,2010,88(10):3320-3326.

[8] CAO G T,XIAO Y P,YANG C M,et al.Effects ofClostridiumbutyricumon growth performance,nitrogen metabolism,intestinal morphology and cecal microflora in broiler chickens[J].Journal of Animal and Veterinary Advances,2012,11(15):2665-2671.

[9] KUO S M,MERHIGE P M,HAGEY L R.The effect of dietary prebiotics and probiotics on body weight,large intestine indices,and fecal bile acid profile in wild type andIL10-/-mice[J].PLoS One,2013,8(3):e60270.

[10] 王騰浩.新型丁酸梭菌篩選及其對斷奶仔豬生長性能和腸道功能影響的研究[D].博士學(xué)位論文.杭州:浙江大學(xué),2015.

[11] 劉婷婷.丁酸梭菌對肉雞生產(chǎn)性能、小腸形態(tài)、免疫功能和腸道微生物的影響[D].碩士學(xué)位論文.杭州:浙江大學(xué),2011.

[12] ICHIKAWA H,KUROIWA T,INAGAKI A,et al.Probiotic bacteria stimulate gut epithelial cell proliferation in rat[J].Digestive Diseases and Sciences,1999,44(10):2119-2123.

[13] ASAI K I,KOMINE Y,KOZUTSUMI T,et al.Predominant subpopulations of T lymphocytes in the mammary gland secretions during lactation and intraepithelial T lymphocytes in the intestine of dairy cows[J].Veterinary Immunology and Immunopathology,2000,73(3/4):233-240.

[14] 楊倩,張小飛.淋巴細(xì)胞在黏膜上皮中的運(yùn)動(dòng)[J].解剖學(xué)雜志,2005,28(2):145-148.

[15] RIEGER J,JANCZYK P,HüNIGEN H,et al.Intraepithelial lymphocyte numbers and histomorphological parameters in the porcine gut afterEnterococcusfaeciumNCIMB 10415 feeding in aSalmonellatyphimuriumchallenge[J].Veterinary Immunology & Immunopathology,2015,164(1/2):40-50.

[16] BAI S P,WU A M,DING X M,et al.Effects of probiotic-supplemented diets on growth performance and intestinal immune characteristics of broiler chickens[J].Poultry Science,2013,92(3):663-670.

[17] LEE S H,YU S Y,NAKAYAMA J,et al.Core2O-glycan structure is essential for the cell surface expression of sucrase isomaltase and dipeptidyl peptidase-Ⅳ during intestinal cell differentiation[J].The Journal of Biological Chemisty,2010,285(48):37683-37692.

[18] 竇茂鑫.不同類型益生菌制劑對脂多糖刺激仔豬腸道吸收和屏障功能的影響[D].碩士學(xué)位論文.武漢:武漢輕工大學(xué),2013.

[19] GOYAL N,RISHI P,SHUKLA G.LactobacillusrhamnosusGG antagonizesGiardiaintestinalisinduced oxidative stress and intestinal disaccharidases:an experimental study[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2013,29(6):1049-1057.

[20] CHEN J W,CHEN Y H,LIN S J.Long-term exposure to oxidized low-density lipoprotein enhances tumor necrosis factor-α-stimulated endothelial adhesiveness of monocytes by activating superoxide generation and redox-sensitive pathways[J].Free Radical Biology and Medicine,2006,40(5):817-826.

[21] RAVAGLIA G,FORTI P,MAIOLI F,et al.Associations of the-174 G/C interleukin-6 gene promoter polymorphism with serum interleukin 6 and mortality in the elderly[J].Biogerontology,2005,6(6):415-423.

[22] ZHANG H Q,DING T T,ZHAO J S,et al.Therapeutic effects ofClostridiumbutyricumon experimental colitis induced by oxazolone in rats[J].World Journal of Gastroenterology,2009,15(15):1821-1828.

[23] 龐敏,盧慶萍,朱麗媛,等.益生菌抵御大鼠急性腹瀉的效果及其對腸道黏膜屏障的影響[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2016,28(5):1462-1470.

[24] CARDINAL J S,ZHAN J H,WANG Y N,et al.Oral hydrogen water prevents chronic allograft nephropathy in rats[J].Kidney International,2010,77(2):101-109.

[25] HAYASHI A,SATO T,KAMADA N,et al.A single strain ofClostridiumbutyricuminduces intestinal IL-10-producing macrophages to suppress acute experimental colitis in mice[J].Cell Host & Microbe,2013,13(6):711-722.