陳曉瑛 王國霞 孫育平 陳 冰 莫文艷 趙紅霞 曹俊明 黃燕華*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所，廣州 510640；2.農(nóng)業(yè)部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣州 510640；3.廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣州 510640；4.廣州飛禧特生物科技有限公司，廣州 510640)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)是當今世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的對蝦三大優(yōu)良品種之一，是我國對蝦的主導養(yǎng)殖品種和重要出口水產(chǎn)品之一，具有生長快、抗病力強等優(yōu)點，養(yǎng)殖經(jīng)濟效益顯著。然而，隨著集約化、規(guī)模化養(yǎng)殖模式及飼料中魚粉替代比例升高，對蝦疾病逐漸增多，抗生素及其他藥品的濫用，導致對蝦代謝紊亂，免疫力和抗病力下降，腸道健康受到威脅，嚴重影響對蝦產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前，通過營養(yǎng)手段調(diào)控腸道健康來降低疾病的發(fā)生，減少藥品的使用已成為現(xiàn)代營養(yǎng)學研究的熱點之一。因此，尋找和開發(fā)綠色環(huán)保、安全有效的無抗添加劑，研究其調(diào)控對蝦的腸道健康具有重要意義[1]。

功能性寡糖是一種新型飼料添加劑[2]。低聚木糖(xylo-oligosaccharides，XOS)是功能性寡糖常用種類，是低度聚合糖，有效成分主要是木二糖和木三糖。與其他功能性寡糖相比，XOS具有獨特的性能，包括不易被動物的消化酶分解、有獨特的酸和熱穩(wěn)定性、無配伍禁忌、可顯著增殖雙歧桿菌等特點，并在低劑量添加就能表現(xiàn)出顯著效果。有研究發(fā)現(xiàn)，XOS具有維持畜禽動物腸道微生物區(qū)系的穩(wěn)定性、促進有益菌增殖、抑制有害菌的生長、改善消化道結(jié)構、增強機體免疫和抗氧化能力、促進生長等作用[3-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加XOS或合生素能提高刺參(ApostichopusjaponicusSelenka)和草魚(Ctenopharyngodonidellus)腸道蛋白酶和淀粉酶活力[7-8]；提高草魚肝胰腺的胰蛋白酶、脂肪酶活力[8]；提高草魚[9]、奧尼羅非魚(Oreochromisaureus×O.niloticus)[10]和凡納濱對蝦[11]腸道中雙歧桿菌等有益菌數(shù)量，減少腸道中大腸桿菌或弧菌等有害菌數(shù)量。但研究XOS對凡納濱對蝦腸道消化酶活力及腸道功能的影響尚未見報道。為此，本試驗在前期研究XOS對凡納濱對蝦幼蝦生長性能和免疫、抗氧化功能作用效果[12]的基礎上，研究了飼料中添加XOS對凡納濱對蝦消化酶活力、腸道形態(tài)和細菌數(shù)量的影響，以便為XOS在甲殼動物飼料中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

以魚粉、豆粕和花生粕為主要蛋白質(zhì)源，以魚油和大豆磷脂為主要脂肪源，以面粉為主要碳水化合物源，配制蛋白質(zhì)和脂肪水平分別為41.90%和6.03%的基礎飼料，其組成及營養(yǎng)水平見表1。在基礎飼料中分別添加200、400和600 mg/kg XOS(購自山東龍力生物科技有限公司，純度95%)，配制3種試驗飼料。各種原料粉碎后均通過60目篩，用SLX-80型雙螺桿壓機制成粒徑為1.2～1.5 mm的顆粒料，55 ℃下烘干，冷卻后過篩，放入密封袋中于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗設計與飼養(yǎng)管理

試驗用凡納濱對蝦蝦苗由正大集團有限公司珠海種苗場提供。用暫養(yǎng)料馴養(yǎng)4周后，在廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所水產(chǎn)研究室的室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行飼養(yǎng)試驗。對蝦飼養(yǎng)于16個容積為350 L的玻璃纖維桶(直徑80 cm，高70 cm，水體容積300 L)，進水速率為3.4 L/min。挑選體質(zhì)健康、個體重量(0.67±0.02) g的凡納濱對蝦苗800尾，隨機分為4組，每組4個重復，每個重復50尾蝦。各組分別投喂基礎飼料和在基礎飼料中分別添加200、400和600 mg/kg XOS的3種試驗飼料，分別記作G0(對照)、G200、G400和G600組。采用飽食投喂法，每天在08:00、14:00和20:00分3次投喂，投喂半個小時后收集殘餌。每天觀察對蝦健康狀況，記錄死亡情況。試驗水源為海水和自來水混合后的咸淡水，經(jīng)過沙濾、消毒后添入，鹽度為4.0‰～5.0‰，自然光照，水溫28.5～32.0 ℃，pH 7.8～8.0，溶氧含量>6.0 mg/L，氨氮含量≤0.1 mg/L，亞硝酸鹽含量≤0.01 mg/L。試驗期為42 d。

表1 基礎飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1)每千克維生素預混料含有 Per kg vitamin premix contented： VA 4 000 000 IU，VD32 000 000 IU，VE 30 g，VK310 g，VB15 g，VB215 g，VB68 g，泛酸鈣 calcium pantothenate 25 g，葉酸 folic acid 2.5 g，生物素 biotin 0.08 g，煙酸 nicotinic acid 30.15 g，VB120.05 g，肌醇 inositol 150 g。

2)每千克礦物質(zhì)預混料含有 Per kg mineral premix contented：MgSO4·H2O 12 g，KCl 90 g，Met-Cu 3 g，F(xiàn)eSO4·H2O 1 g，ZnSO4·H2O 10 g，Ca(IO3)20.06 g，Met-Co 0.16 g，NaSeO30.003 6 g。

3)營養(yǎng)水平為實測值。Nutrient levels were measured values.

1.3 樣品采集及指標檢測

1.3.1 樣品采集

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，禁食12 h。每個重復中隨機取3尾蝦，剝離腸道，放入10%的福爾馬林溶液中固定，用于腸道形態(tài)分析。每個重復再隨機取3尾對蝦置于冰盤內(nèi)解剖，剝離對蝦的胃、腸道和肝胰腺，剪開胃和腸道，用對蝦生理鹽水清洗胃、腸道內(nèi)容物，用濾紙擦干表面水分，裝入Eppendorf管中，置于-20 ℃冰箱中保存，用于胃、腸道和肝胰腺消化酶活力測定。同時，每個重復隨機取3尾對蝦，在無菌操作下，將對蝦解剖，取出腸道裝入Eppendorf管中，置于4 ℃冰箱內(nèi)，用于腸道細菌數(shù)量測定。

肝胰腺、胃和腸道組織勻漿上清液：從-20 ℃冰箱中取出肝胰腺、胃和腸道樣品，4 ℃解凍，然后稱取一定質(zhì)量的樣品，剪碎，放入玻璃勻漿器中，加入6倍樣品重的預冷的生理鹽水，在冰浴中勻漿(T10 basic型電動玻璃勻漿機，IKA)，充分勻漿后，倒入離心管中，再加入3倍樣品重的預冷生理鹽水，沖洗勻漿器，倒入離心管，制成10%組織勻漿液。取一部分置于4 ℃冰箱，用于測定脂肪酶活力。其余以3 500 r/min離心10 min，取上清液，分裝成2份，一份置于4 ℃冰箱保存，用于測定蛋白酶和淀粉酶活力；一份置于-80 ℃冰箱中保存，用于組織總蛋白(TP)含量測定。4 ℃冰箱內(nèi)的腸道樣品采用同樣的勻漿方法，制成10%腸道勻漿液。

1.3.2 消化酶活力測定

蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力測定分別按王玉梅等[13]的方法、3,5-二硝基水楊酸顯色法(DNS法)[14]和聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法[15]。

1.3.3 勻漿上清液TP含量測定

制備肝胰腺和腸道勻漿上清液，以牛血清蛋白做標準，用考馬斯亮藍法測定[16]。

1.3.4 腸道組織切片觀察

從10%的福爾馬林溶液中取對蝦腸道，常規(guī)法脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，用蘇木精-伊紅(HE)染色，樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察其形態(tài)和結(jié)構的變化。按組織學樣品采集與圖像數(shù)據(jù)測量中的隨機等距原則選取測量對象。腸壁厚度：在每張切片中隨機測量30處肌層的厚度，取平均值。腸絨毛高度：從絨毛的頂端至肌部凹陷處的垂直距離表示，每張切片隨機選取10處進行測量，取平均值。

1.3.5 腸道細菌數(shù)量測定

參考李繼秋[17]的稀釋涂布法。取10%勻漿液，依次以10倍系列稀釋，充分振蕩混勻，分別取0.1 mL的10-3、10-4和10-5菌液來涂布，每個重復的稀釋菌液進行3個平行測定。在28 ℃培養(yǎng)箱中，無光照，培養(yǎng)基的pH為7.0～7.4，總菌和弧菌靜止培養(yǎng)24 h，乳酸菌靜止培養(yǎng)48 h。雙歧桿菌為厭氧菌，菌液涂布后，再倒入一層40 ℃左右的雙歧桿菌瓊脂培養(yǎng)基(BBL瓊脂培養(yǎng)基)，置于28 ℃培養(yǎng)箱中，無光照，靜止培養(yǎng)48 h。根據(jù)菌落數(shù)可數(shù)性原則，對微生物進行平板菌落計數(shù)。選取菌落數(shù)為30～300的稀釋度，求3個平行的菌落數(shù)平均值，并計算每克腸道所含的細菌數(shù)量，以對數(shù)值[lg(CFU/g)]表示。培養(yǎng)基均采購于廣東環(huán)凱微生物有限公司。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示。采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計，對數(shù)據(jù)作單因素方差分析(one-way ANOVA)。若組間差異顯著，再用Duncan氏法進行多重比較，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 飼料中添加XOS對凡納濱對蝦腸道、肝胰腺和胃消化酶活力的影響

由表2可知，與對照組相比，飼料中添加XOS能顯著提高對蝦腸道的淀粉酶和肝胰腺的蛋白酶活力(P<0.05)，對蝦腸道、肝胰腺和胃的其他消化酶活力也有不同程度的提高。G200組對蝦腸道、肝胰腺和胃的淀粉酶活力最高，顯著高于對照組(P<0.05)。G200組對蝦腸道的蛋白酶活力最高，其次是G400組，且均顯著高于對照組(P<0.05)；G400組對蝦肝胰腺和胃的蛋白酶活力最高，且顯著高于對照組(P<0.05)。G400組對蝦腸道的脂肪酶活力最高，且顯著高于對照組(P<0.05)；對蝦肝胰腺脂肪酶活力隨著飼料中XOS添加量的增加而升高，其中G400和G600組顯著高于對照組(P<0.05)。各組對蝦胃的脂肪酶活力無顯著差異(P>0.05)。

2.2 飼料中添加XOS對凡納濱對蝦肝胰腺和腸道TP含量的影響

由表3可知，各試驗組對蝦肝胰腺和腸道TP含量均高于對照組，并呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，其中G400肝胰腺TP含量最高，顯著高于對照組(P<0.05)，與其他試驗組沒有顯著差異(P>0.05)。G400組腸道TP含量最高，但各組間差異不顯著(P>0.05)。

表2 飼料中添加XOS對凡納濱對蝦腸道、肝胰腺和胃消化酶活力的影響

同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表3 飼料中添加XOS對凡納濱對蝦肝胰腺和腸道TP含量的影響

2.3 飼料中添加XOS對凡納濱對蝦腸壁厚度和腸絨毛高度的影響

由表4可知，凡納濱對蝦腸壁厚度和腸絨毛高度均隨著飼料中XOS添加量的增加呈先升高后降低的趨勢，其中以G400組最高，且顯著高于對照組(P<0.05)；而G400組對蝦腸壁厚度與其他試驗組無顯著差異(P>0.05)。各組凡納濱對蝦腸道組織切片圖見圖1。

表4 飼料中添加XOS對凡納濱對蝦腸壁厚度和腸絨毛高度的影響

2.4 飼料中添加XOS對凡納濱對蝦腸道細菌數(shù)量的影響

由表5可知，各試驗組的對蝦腸道總菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著高于對照組(P<0.05)，腸道弧菌(Vibrio)數(shù)量顯著低于對照組(P<0.05)。各試驗組乳酸菌數(shù)量不同程度地高于對照組，但各組間無顯著差異(P>0.05)。

圖中V表示腸絨毛，J表示腸壁。

V in the figure represented intestinal villus, and J represented the intestinal wall.

圖1凡納濱對蝦腸道組織切片圖

Fig.1 Intestinal section morphology diagram of

Litopenaeusvannamei(100×)

3 討 論

3.1 飼料中添加XOS對凡納濱對蝦消化酶活力的影響

腸道是動物體內(nèi)消化吸收的主要場所，其消化酶活力的高低反映基本的消化生理特征，直接影響動物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，進而影響動物的生長和發(fā)育，是反映機體消化能力是否良好的重要指標。本試驗中，隨著飼料中XOS添加量的增加，腸道的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活力均先升高后下降，其總的變化趨勢與本實驗室前期研究中所呈現(xiàn)的增重率、特定生長率表現(xiàn)相似，其中G200組腸道的蛋白酶和淀粉酶活力顯著高于對照組，該組的增重率和特定生長率也最好[12]。以上結(jié)果間接表明，腸道消化酶活力與生長指標具有一定的相關性。這與XOS在異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[18]、奧尼羅非魚[19]、仿刺參[7]和凡納濱對蝦[11]在腸道中的消化酶活力的研究結(jié)果相似。Sugita等[20]研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群在淡水魚的淀粉消化中具有非常重要的作用。例如，雙歧桿菌、乳酸桿菌及其代謝產(chǎn)物能夠促進動物消化酶的分泌和腸道蠕動，從而提高腸道的消化酶活力，而有害菌會損害腸黏膜上的絨毛和微絨毛，減少消化酶的分泌[21]。本試驗證實，XOS能促進有益菌雙歧桿菌、乳酸菌等的增殖，抑制有害菌弧菌的生長。此外，XOS還可以增強腸絨毛高度和腸壁厚度。由此可知，XOS主要通過改善微生物區(qū)系和腸道組織結(jié)構來促進腸道消化酶的分泌。但是，試驗中腸道TP含量與腸道蛋白酶活力變化趨勢不一致，說明腸道中蛋白質(zhì)沉積不僅受到蛋白酶活力的影響，可能還受其他因素(如腸道微生物數(shù)量)的影響。

表5 飼料中添加XOS對凡納濱對蝦腸道細菌數(shù)量的影響

目前，有關低聚寡糖對動物肝胰臟和胃的消化酶活力影響的研究報道很少，而且作用效果不一致。飼糧中添加果寡糖(fructooligosaccharide，F(xiàn)OS)對肉雞[22]和飼料中添加XOS對凡納濱對蝦[23]消化道消化酶活力均無顯著影響。而肖明松等[24]和熊沈?qū)W等[25]分別發(fā)現(xiàn)，在中華鱉(Trionyxsinensis)和異育銀鯽的飼料中添加適量低聚寡糖，能顯著提高肝胰臟蛋白酶活力。在本試驗中，XOS能顯著提高肝胰腺和胃的消化酶活力。對蝦肝胰腺和胃各消化酶沒有表現(xiàn)出與前期研究顯示的生長性能之間的相關性。但是肝胰腺的TP含量的變化趨勢與肝胰腺的蛋白酶活力的變化趨勢一致，說明肝胰腺的蛋白質(zhì)沉積與蛋白酶活力具有一定的相關性。

3.2 飼料中添加XOS對凡納濱對蝦腸道形態(tài)的影響

腸道健康是動物快速生長和保持健康的重要保障。其中腸道黏膜形態(tài)結(jié)構是機體消化吸收的結(jié)構基礎，腸壁厚度、隱窩深度和絨毛高度的增加，可增強動物的消化吸收能力。目前關于低聚寡糖對動物腸道形態(tài)的研究有一定的進展，但XOS的研究較少。有學者發(fā)現(xiàn)，飼料中添加適量低聚寡糖能明顯改善羅非魚[10,26-27]、草魚[28]、齊口裂腹魚(Schizothoraxprenati)[29]的腸道形態(tài)。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼料中添加XOS能增加對蝦腸道腸壁厚度和腸絨毛高度，這將有利于腸道吸收面積的增加和營養(yǎng)物質(zhì)消化利用率的提高[30]。分析其原因，應該是XOS作為益生菌的增殖因子，促進了有益微生物大量增殖，調(diào)節(jié)了微生態(tài)平衡，改善了腸道組織形態(tài)和代謝功能[31]。另外，腸道中有益菌的代謝產(chǎn)物如丁酸、丙酸和乙酸等短鏈脂肪酸可以作為能源促進黏膜細胞增殖，有利于腸壁厚度和腸道絨毛高度的增加[32-33]。

3.3 飼料中添加XOS對凡納濱對蝦腸道細菌數(shù)量的影響

腸道細菌的組成和數(shù)量是評價腸道健康的重要指標。腸道細菌對腸細胞增殖、組織形態(tài)有極大的影響[34]，對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、機體免疫、正常生長等起著重要作用。低聚寡糖影響腸道細菌的作用已經(jīng)在畜禽和水產(chǎn)動物中有所報道，在飼料中添加適量的XOS能提高畜禽動物腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量，降低有害菌大腸桿菌數(shù)量[34-38]。在水產(chǎn)動物奧尼羅非魚[10]、草魚[8]、刺參[39]等也有類似的效果。本試驗亦證實，飼料中添加XOS對凡納濱對蝦腸道乳酸菌數(shù)量沒有顯著影響，但能顯著提高雙歧桿菌和總菌數(shù)量，顯著降低弧菌數(shù)量。XOS作為有益菌的碳源，能增殖有益菌，使有益菌形成競爭優(yōu)勢，抑制了有害菌的定植，同時雙歧桿菌等有益菌能形成一個生物學屏障組織阻止致病菌的侵入[39-40]。Pestova等[41]研究發(fā)現(xiàn)，XOS具有與許多病原微生物外源凝集素相似的結(jié)構物質(zhì)，能競爭性與病原菌結(jié)合，由于XOS具有不被消化道內(nèi)源酶分解的特點，可攜帶著病原菌排出，起到了防止病原菌在腸道內(nèi)繁殖的作用。在這些作用下，XOS能顯著增加有益菌增殖，抑制有害菌增殖。

4 結(jié) 論

飼料中添加適量的XOS能顯著提高凡納濱對蝦幼蝦消化酶活力，改善腸道形態(tài)，提高腸道總菌和雙歧桿菌數(shù)量，降低弧菌數(shù)量。

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