張 憲 張樂(lè)穎 張立蘭 陳 亮* 唐湘方 張宏福
(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193;2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,邯鄲 056000)
外源酶制劑具有提高飼料養(yǎng)分消化率、改善動(dòng)物生長(zhǎng)性能和維持動(dòng)物健康等優(yōu)點(diǎn),已成為飼料營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。但外源酶制劑的效果不僅取決于其本身的酶學(xué)特性,還與目標(biāo)動(dòng)物的生理狀況及基礎(chǔ)飼糧類(lèi)型密切相關(guān)。因此,準(zhǔn)確評(píng)價(jià)和使用飼用酶制劑的問(wèn)題亟待解決。傳統(tǒng)的動(dòng)物試驗(yàn)法評(píng)定飼用酶常耗費(fèi)大量的人力、財(cái)力和物力,測(cè)試條件不可控性,結(jié)果變異大,不能在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行評(píng)定[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)添加單一α-淀粉酶可提高飼糧的有機(jī)物消化率和淀粉消化率以及代謝能,提高肉仔雞的日增重和飼料轉(zhuǎn)化率[3-6];但也有研究顯示α-淀粉酶對(duì)肉仔雞前期(1~14日齡)飼糧的淀粉消化率沒(méi)有促進(jìn)作用[7],對(duì)肉仔雞的生長(zhǎng)性能沒(méi)有產(chǎn)生正效應(yīng)[8]。外源淀粉酶的作用效果受到飼糧類(lèi)型及酶制劑的來(lái)源和添加劑量等因素的影響,所得結(jié)果不盡一致。國(guó)內(nèi)外學(xué)者們?cè)噲D探索研究快速、易標(biāo)準(zhǔn)化的外源酶制劑有效性評(píng)價(jià)的體外法。Alabi等[9]和Malathi等[10]均提出胃蛋白酶-胰液素體外法能夠快速評(píng)價(jià)外源酶的有效性和穩(wěn)定性。Park等[11]研究表明含有α-外源淀粉酶的復(fù)合酶制劑增加了玉米和小麥的體外干物質(zhì)消化率。雖然體外法評(píng)定外源淀粉酶的應(yīng)用研究取得一定進(jìn)展,但各實(shí)驗(yàn)室評(píng)定酶制劑的方法、試驗(yàn)材料及條件變異性大,導(dǎo)致評(píng)價(jià)外源酶制劑有效性的方法不穩(wěn)定。本課題組長(zhǎng)期研究飼用酶制劑的有效性快速評(píng)價(jià)方法,通過(guò)仿生法評(píng)定了外源蛋白酶對(duì)飼糧養(yǎng)分消化率的影響[12],建立了豬禽飼糧非淀粉多糖酶快速篩選平臺(tái),利用仿生法研究了非淀粉多糖酶的作用效果[13]。但利用體外法評(píng)價(jià)單一外源淀粉酶有效性的報(bào)道極少。本試驗(yàn)旨在利用單胃動(dòng)物仿生消化系統(tǒng)(SDS-Ⅱ)模擬雞胃階段和全消化道的消化過(guò)程,通過(guò)研究外源淀粉酶對(duì)飼糧體外干物質(zhì)消化率(invitrodry matter digestibility,IVDMD)、體外總能消化率(invitrogross energy digestibility,IVGED)、體外表觀(guān)粗蛋白質(zhì)消化率(invitroapparent crude protein digestibility,IVACPD)、體外標(biāo)準(zhǔn)化粗蛋白質(zhì)消化率(invitrostandardized crude protein digestibility,IVSCPD)、體外淀粉消化率(invitrostarch digestibility,IVSTD)和體外代謝能(invitrometabolic energy,IVME)的影響,為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)和使用飼用酶制劑提供依據(jù)。
本試驗(yàn)于2016年12月至2017年3月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。
本試驗(yàn)采用2×4雙因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)飼糧參照我國(guó)《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》[14](NY/T 33—2004)和NRC(1994)[15]雞營(yíng)養(yǎng)需要配制肉雞1~21日齡和22~42日齡基礎(chǔ)飼糧。以2種基礎(chǔ)飼糧為對(duì)照組,分別在2種基礎(chǔ)飼糧中添加1 840、9 200和18 400 U/g的外源α-淀粉酶(α-淀粉酶由北京益農(nóng)飼料中心提供,活性為24 500 U/g,1個(gè)淀粉酶活性單位定義為25 ℃、pH=6.90條件下作用1 min釋放1 μmol麥芽糖所具有的酶的活性)作為試驗(yàn)組,共8個(gè)飼糧樣品組,每組設(shè)5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)設(shè)1根消化管。飼糧樣品采用四分法取樣后經(jīng)試驗(yàn)用飼料粉碎機(jī)粉碎過(guò)60目篩,充分混合均勻后,保存于-20 ℃?zhèn)溆??;A(chǔ)飼糧組成見(jiàn)表1,試驗(yàn)飼糧常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量見(jiàn)表2。
本試驗(yàn)采用SDS-Ⅱ,通過(guò)配制胃緩沖液、小腸緩沖液、模擬胃液、模擬小腸液,模擬雞胃階段和全消化道消化過(guò)程,并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,從而評(píng)定外源淀粉酶對(duì)1~21日齡和22~42日齡肉雞玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧IVDMD、IVGED、IVACPD、IVSCPD、IVSTD及IVME的影響。操作步驟及參數(shù)設(shè)置均按《單胃動(dòng)物仿生消化系統(tǒng)操作手冊(cè)》[16]進(jìn)行。
1.2.1 胃緩沖液、小腸緩沖液、模擬胃液、模擬小腸液的配制
胃緩沖液及小腸緩沖液的組成見(jiàn)表3。各段緩沖液的配制均用去離子水溶解,在41 ℃下調(diào)節(jié)溶液的pH并定容到2 000 mL。胃段緩沖液用2 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.00,小腸前段和小腸后段緩沖液均用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH分別至6.50和7.99。配制好的緩沖液放入SDS-Ⅱ的相應(yīng)位置進(jìn)行預(yù)熱。
模擬胃液(胃蛋白酶活性1 550 U/mL):稱(chēng)取 387.5 kU的胃蛋白酶(Sigma,P7000)溶解于250 mL pH 2.0的鹽酸緩沖溶液中(41 ℃下標(biāo)定pH),緩慢攪拌至溶解(臨用前配制)。
模擬小腸液(淀粉酶活性401.46 U/mL,胰蛋白酶活性49.28 U/mL,糜蛋白酶活性11.31 U/mL):稱(chēng)取110.40 kU淀粉酶(Sigma,A3306)、13.55 kU胰蛋白酶(Amersco,0785)、3.11 kU糜蛋白酶(Amersco,0164)溶解于25 mL去離子水中,緩慢攪拌直至溶解(臨用前配制)。
表1 基礎(chǔ)飼糧組成(風(fēng)干基礎(chǔ))
預(yù)混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of diets:VA 12 000 IU,VB13.5 mg,VB28.6 mg,VB120.02 mg,VD325 000 IU,VE 20 IU,VK332.5 mg,生物素 biotin 0.20 mg,葉酸 folic acid 1.00 mg,D-泛酸D-pantothenic acid 15 mg,煙酸 nicotinic acid 50 mg,Cu (as copper sulfate) 8 mg,F(xiàn)e (as ferrous sulfate) 80 mg,Mn (as manganese sulfate) 120 mg,Zn (as zinc sulfate) 110 mg,Se (as sodium selenite) 0.30 mg。
表2 試驗(yàn)飼糧常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量(干物質(zhì)基礎(chǔ))
1.2.2 操作步驟
稱(chēng)取2.000 0 g飼糧樣品(精確到0.000 2 g),加入20 mL模擬胃液,無(wú)損轉(zhuǎn)移到裝有透析袋(截留分子質(zhì)量為14 000 u)的模擬消化管中,用膠塞塞嚴(yán),并安裝于預(yù)熱好的SDS-Ⅱ上,胃階段模擬消化參數(shù)溫度為41 ℃,消化時(shí)間為4 h。在胃階段模擬消化結(jié)束后,將2 mL模擬小腸液加入小腸消化液儲(chǔ)備室,繼續(xù)進(jìn)行小腸階段的模擬消化,其消化參數(shù)溫度為41 ℃,小腸前段和小腸后段消化時(shí)間均為7.5 h。
消化過(guò)程結(jié)束后,將透析袋內(nèi)未消化殘?jiān)鼰o(wú)損轉(zhuǎn)移到已知絕干重量的培養(yǎng)皿中,置于65 ℃烘箱中8~10 h后,再將烘箱調(diào)至105 ℃恒重4 h,記錄重量。
表3 胃緩沖液及小腸緩沖液組成
將培養(yǎng)皿中的消化殘?jiān)抗蜗拢?.3 g殘?jiān)鼫y(cè)定殘?jiān)值鞍踪|(zhì)含量,取0.1 g殘?jiān)鼫y(cè)定殘?jiān)矸酆?,剩余殘?jiān)Q(chēng)重后轉(zhuǎn)移到已知絕干重量的玻璃砂芯坩堝中,用無(wú)水乙醇進(jìn)行3次脫脂后,待無(wú)水乙醇完全揮發(fā),置于105 ℃烘箱恒重,記錄重量。
在進(jìn)行仿生消化試驗(yàn)時(shí),同步測(cè)定飼糧樣品的干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和淀粉含量及總能。
1.2.3 計(jì)算公式
數(shù)據(jù)計(jì)算公式如下:
IVDMD(%)=100×(M1-M2)/M1;IVGED(%)=100×(GE1-GE2)/GE1;IVACPD(%)=100×(CP1-CP2)/CP1;IVSCPD(%)=100×(CP1-CP2+CP0)/CP1;IVSTD(%)=100×(ST1-ST2)/ST1;IVME(MJ/kg)=(GE1-GE2)/(GE1×1 000)。
式中:M1為上樣飼糧干物質(zhì)重量(g);M2為未消化殘?jiān)晌镔|(zhì)重量(g);GE1為上樣飼糧總能(J);GE2為未消化殘?jiān)偰?J);CP0為粗蛋白質(zhì)內(nèi)源損失量(g);CP1為上樣飼糧粗蛋白質(zhì)重量(g);CP2為未消化殘?jiān)值鞍踪|(zhì)重量(g);ST1為上樣飼糧淀粉重量(g);ST2為未消化殘?jiān)矸圪|(zhì)量(g)。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.2的MEANS模塊對(duì)基本統(tǒng)計(jì)量進(jìn)行分析,用GLM模塊對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析,當(dāng)存在交互作用(P<0.05)時(shí),對(duì)平均值進(jìn)行Turkey法多重比較,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,P<0.05為差異顯著。
由表4可知,飼糧營(yíng)養(yǎng)水平和淀粉酶添加劑量對(duì)肉雞飼糧IVDMD、IVGED和IVME存在交互作用(P<0.01)。在飼糧中添加不同劑量的淀粉酶后,胃階段的IVDMD和IVGED均顯著增加(P<0.05),1~21日齡飼糧的IVDMD和IVGED顯著高于22~42日齡飼糧(P<0.01);1 840 U/g淀粉酶組全消化道的IVDMD和IVGED顯著低于其他組(P<0.05),22~42日齡飼糧全消化道IVDMD和IVGED顯著高于1~21日齡飼糧(P<0.05);18 400 U/g淀粉酶組飼糧的IVME顯著高于其他組(P<0.05),22~42日齡飼糧的IVME顯著高于1~21日齡飼糧(P<0.05)。
在1~21日齡飼糧中,9 200和18 400 U/g淀粉酶組胃階段、全消化道的IVDMD和胃階段的IVGED均顯著高于對(duì)照組和1 840 U/g淀粉酶組(P<0.05);9 200和18 400 U/g淀粉酶組的IVME顯著高于對(duì)照組(P<0.05),分別較對(duì)照組提高了0.14和0.18 MJ/kg。
在22~42日齡飼糧中,1 840、9 200和18 400 U/g淀粉酶組胃階段的IVDMD和IVGED均顯著高于對(duì)照組(P<0.05);與對(duì)照組相比,1 840 U/g淀粉酶組全消化道IVDMD和IVGED均顯著降低(P<0.05),9 200 U/g淀粉酶組全消化道IVDMD顯著降低(P<0.05);1 840 U/g淀粉酶組的IVME顯著低于對(duì)照組(P<0.05),9 200和18 400 U/g淀粉酶組與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。
表4 飼糧營(yíng)養(yǎng)水平和淀粉酶添加劑量對(duì)肉雞飼糧IVDMD和IVGED以及IVME的影響
相同因素下,同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。
Under the same factor, values in the same row with the same letter or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.
由表5可知,飼糧營(yíng)養(yǎng)水平和淀粉酶添加劑量對(duì)肉雞飼糧IVACPD、IVSCPD和IVSTD存在交互作用(P<0.01)。1 840和9 200 U/g淀粉酶組的全消化道IVACPD、IVSCPD顯著高于對(duì)照組(P<0.05),且22~42日齡飼糧的全消化道IVACPD、IVSCPD顯著高于1~21日齡飼糧(P<0.05);8種飼糧的全消化道IVSTD均在99.40%以上,9 200和18 400 U/g淀粉酶組的全消化道IVSTD顯著低于對(duì)照組(P<0.05),1~21日齡飼糧的全消化道IVSTD顯著高于22~42日齡飼糧(P<0.05)。
在1~21日齡飼糧中,9 200和18 400 U/g淀粉酶組的全消化道IVACPD、IVSCPD均顯著高于對(duì)照組(P<0.05);9 200和18 400 U/g淀粉酶組的全消化道IVSTD低于對(duì)照組(P<0.01)。
在22~42日齡飼糧中,18 400 U/g淀粉酶組的全消化道IVACPD、IVSCPD均顯著低于其他組(P<0.05),1 840和9 200 U/g淀粉酶組上述指標(biāo)與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05);各淀粉酶添加組的全消化道IVSTD與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。
表5 飼糧營(yíng)養(yǎng)水平和淀粉酶添加劑量對(duì)肉雞飼糧IVACPD、IVSCPD和IVSTD的影響
外源淀粉酶的作用效果受到淀粉酶來(lái)源、添加劑量和飼糧營(yíng)養(yǎng)水平等因素的影響。Gracia等[3]研究發(fā)現(xiàn),添加單一α-淀粉酶可提高玉米-豆粕飼糧有機(jī)物和淀粉的消化率以及代謝能,但對(duì)粗蛋白質(zhì)和粗脂肪的消化率沒(méi)有顯著影響。單一α-淀粉酶也可提高肉仔雞的日增重和飼料轉(zhuǎn)化率[4-5]。但Mahagna等[7]的研究顯示α-淀粉酶對(duì)肉仔雞前期(1~14日齡)飼糧的淀粉消化率沒(méi)有促進(jìn)作用,Kaczmarek等[6]也發(fā)現(xiàn)添加單一α-淀粉酶對(duì)玉米-豆粕型飼糧淀粉和粗蛋白質(zhì)的消化率以及代謝能沒(méi)有顯著影響,對(duì)肉仔雞的生產(chǎn)性能沒(méi)有正效應(yīng)。本試驗(yàn)利用SDS-Ⅱ分析了飼糧營(yíng)養(yǎng)水平和淀粉酶添加劑量對(duì)肉雞飼糧體外養(yǎng)分消化率和代謝能的影響,為快速準(zhǔn)確評(píng)價(jià)和使用飼用酶制劑提供參考。
外源酶制劑對(duì)肉雞養(yǎng)分消化的影響作用與飼糧營(yíng)養(yǎng)水平密切相關(guān)[17-18],但單一外源淀粉酶與飼糧營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)肉雞飼糧養(yǎng)分消化率的影響報(bào)道很少。本研究中1~21日齡飼糧為高蛋白質(zhì)、低能量飼糧,22~42日齡飼糧為低蛋白質(zhì)、高能量飼糧,研究結(jié)果表明飼糧營(yíng)養(yǎng)水平與淀粉酶添加劑量對(duì)肉雞飼糧體外養(yǎng)分消化率存在交互作用,外源淀粉酶對(duì)1~21日齡飼糧營(yíng)養(yǎng)水平下飼糧體外養(yǎng)分消化率的影響更明顯,飼糧能量水平越低,外源淀粉酶的作用越明顯,相關(guān)動(dòng)物試驗(yàn)也得到相似的結(jié)果。在降低代謝能 836 kJ/kg的肉仔雞飼糧中,復(fù)合酶制劑(含有α-淀粉酶)對(duì)18~21日齡飼糧全消化道干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)及能量消化率提升效果比42日齡飼糧更明顯[17]。黃學(xué)琴[18]也發(fā)現(xiàn)酶制劑提高了不同營(yíng)養(yǎng)水平的肉鴨飼糧的粗蛋白質(zhì)利用率,飼糧代謝能水平越低,外源酶制劑對(duì)粗蛋白質(zhì)消化率的作用越明顯。
由于幼雛雞消化系統(tǒng)發(fā)育不成熟,自身分泌的消化酶不足以消化吸收飼料中的養(yǎng)分,影響后續(xù)的生長(zhǎng)發(fā)育,有必要添加外源酶來(lái)補(bǔ)充內(nèi)源酶的不足并促進(jìn)腸道的早期發(fā)育。Gracia等[3]研究發(fā)現(xiàn),在飼糧中添加外源淀粉酶后,肉仔雞在7日齡時(shí)提高了粗蛋白質(zhì)消化率和淀粉消化率,到28日齡時(shí)淀粉消化率仍高于對(duì)照組,但降低了粗蛋白質(zhì)的消化率且差異不顯著。本試驗(yàn)通過(guò)SDS-Ⅱ分別模擬肉仔雞1~21日齡和22~42日齡飼糧的體內(nèi)消化過(guò)程,當(dāng)添加9 200和18 400 U/g淀粉酶時(shí)顯著提高了1~21日齡飼糧的IVACPD和IVSCPD,但對(duì)22~42日齡飼糧的IVACPD和IVSCPD提升效果不顯著,這與前人采用動(dòng)物試驗(yàn)法[17]研究外源淀粉酶影響粗蛋白質(zhì)消化率的結(jié)果相似,可能是外源淀粉酶與內(nèi)源蛋白酶互作的結(jié)果。蔣正宇等[19]在21日齡肉仔雞玉米-豆粕型飼糧中分別添加250、750、2 250 mg/kg微生物α-淀粉酶,均不同程度提高了肉仔雞前腸內(nèi)容物中總蛋白酶和胰蛋白酶活性。本試驗(yàn)中粗蛋白質(zhì)消化率的提高可能是由于外源淀粉酶增加了內(nèi)源酶的活性,從而改善了飼糧養(yǎng)分消化率,但也有研究表明粗蛋白質(zhì)消化率的提高可能是由于外源淀粉酶通過(guò)分解淀粉,減少了淀粉大分子空間占位對(duì)蛋白質(zhì)消化的阻隔作用,從而促進(jìn)了蛋白質(zhì)的消化吸收[20]。
盡管添加9 200和18 400 U/g淀粉酶在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低了1~21日齡飼糧的全腸道IVSTD,但外源淀粉酶對(duì)淀粉消化率的提升作用甚微,因?yàn)樵隗w外模擬消化條件下,玉米-豆粕型飼糧中的淀粉幾乎完全降解,8種飼糧的全腸道IVSTD均在99.40%以上。淀粉消化率與動(dòng)物自身淀粉酶分泌量相關(guān),肉仔雞在4日齡時(shí)自身淀粉酶的分泌量較低,但隨日齡的增長(zhǎng)其分泌量隨之增加,然后趨于穩(wěn)定[21]。
由于胃內(nèi)環(huán)境呈酸性,容易破壞外源酶活性,Ao等[22]通過(guò)模擬禽類(lèi)不同消化道的pH,對(duì)β-葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、α-半乳糖苷酶和蛋白酶進(jìn)行活性測(cè)定,結(jié)果表明禽類(lèi)消化道的pH可能是外源酶活性的最大限制性因素。在本試驗(yàn)條件下,添加9 200和18 400 U/g淀粉酶均提高了1~21日齡和22~42日齡飼糧胃階段的IVDMD,說(shuō)明試驗(yàn)中所用的外源淀粉酶具有耐胃酸性,并且提高了胃階段的養(yǎng)分消化率。相似的研究也表明,將含有α-淀粉酶(活性≥8.5×106U/t)的復(fù)合酶添加到玉米和豆粕等原料中,測(cè)得玉米的IVDMD和IVGED分別提高了2.07%和2.82%,豆粕的IVDMD和IVGED分別提高了5.00%和0.26%[23]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,添加外源淀粉酶后,肉雞飼糧的IVDMD、IVGED和IVME得到提高,說(shuō)明在體外消化試驗(yàn)中外源淀粉酶的添加能夠提高飼糧中的可消化養(yǎng)分(如粗蛋白質(zhì))。
研究認(rèn)為少量添加酶制劑能增強(qiáng)內(nèi)源酶作用,中等劑量的添加對(duì)內(nèi)源酶有降解作用,高劑量添加外源酶則又顯示正效應(yīng)[24],外源酶與內(nèi)源酶的作用效果取決于酶的來(lái)源、作用底物、添加量等因素,其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。
① 外源淀粉酶的添加提高了肉雞飼糧胃階段的IVDMD、IVDGE,1 840和9 200 U/g外源淀粉酶提高了肉雞飼糧的IVACPD和IVSCPD,18 400 U/g淀粉酶提高了肉雞飼糧的IVME。
② 玉米-豆粕型飼糧中淀粉幾乎完全降解,外源淀粉酶對(duì)IVSTD的影響可以忽略。
提高森林撫育規(guī)劃性是保證森林撫育技術(shù)實(shí)施的重要手段,因此通過(guò)圍繞著森林撫育的實(shí)際需求制定一個(gè)完善的撫育政策,從而以現(xiàn)有的技術(shù)手段來(lái)提高森林撫育工作的質(zhì)量。同時(shí),還要不斷的提高森林撫育工作的宣傳力度,真正的為營(yíng)造一個(gè)良好的森林撫育氛圍進(jìn)行努力,積極引導(dǎo)社會(huì)各界力量參與到森林撫育與經(jīng)營(yíng)管理活動(dòng)中來(lái),從而提森林撫育的社會(huì)效益。
③ 飼糧營(yíng)養(yǎng)水平和外源淀粉酶添加劑量對(duì)肉雞飼糧體外養(yǎng)分消化率和代謝能存在交互作用,22~42日齡飼糧的體外養(yǎng)分消化率和代謝能均高于1~21日齡飼糧。
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動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)2018年4期