胡振華 楊永平 楊 宇 葉勝強(qiáng) 王麗霞 鄧 兵 陳 星 凌明湖 龔 萍* 龔炎長

(1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430208；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；3.武漢市動物疫病預(yù)防控制中心，武漢 430016)

用于動物生產(chǎn)中的抗生素在提高生長性能的同時(shí)也引入許多問題[1]。無論是治療還是預(yù)防上，抗生素使用導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性、正常微生物區(qū)系的不平衡、食品中藥物殘留等問題在全球不斷提升。目前，益生菌作為抗生素的替代品被成功應(yīng)用，動物飼糧中添加益生菌具有預(yù)防疾病、促進(jìn)生長的作用。益生菌的出現(xiàn)也使得現(xiàn)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)的疾病治療手段發(fā)生了巨大改變，從以前抗生素主導(dǎo)的化學(xué)治療手段進(jìn)入微觀生物免疫的新領(lǐng)域。研究表明，益生菌不僅可以調(diào)節(jié)保持腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)的共生細(xì)菌，而且還可以增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞的屏障功能以及促進(jìn)腸道健康[2-5]。在動物飼糧中添加益生菌可以減少腸道大腸桿菌、沙門氏菌以及梭菌等病原菌的數(shù)量[6-8]。芽孢桿菌作為一種新型的益生菌，因其內(nèi)生孢子性質(zhì)穩(wěn)定，能夠抵抗低溫、化學(xué)、紫外線輻射等大量物理應(yīng)激因子；同時(shí)可以產(chǎn)生較強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等，能夠有效降解復(fù)雜的碳水化合物[9]；以及具有耐酸、耐鹽、耐高溫、易儲存加工和運(yùn)輸?shù)奶匦訹10]；除此之外還具有消除病原菌、抗氧化、廣譜抗菌、免疫調(diào)節(jié)和食品發(fā)酵的能力，是畜禽養(yǎng)殖中研究和使用較多的一類益生菌[11-14]。其中枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和地衣芽孢桿菌等已在我國得到批準(zhǔn)可用作飼料添加劑。已有研究表明，枯草芽孢桿菌具有促進(jìn)畜禽對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、提高飼料利用率、減少腸道中有害菌群、調(diào)節(jié)胃腸道微生態(tài)平衡以及提高抗病力等多種功效[15-17]。但枯草芽孢桿菌對肉鴨系統(tǒng)性的研究報(bào)道相對較少。因此，本試驗(yàn)通過利用前期篩選出的一株枯草芽孢桿菌作為益生菌添加到肉鴨飼糧中，并以商品化復(fù)合芽孢桿菌為對照，研究其對肉鴨生長性能、免疫器官指數(shù)、腸道形態(tài)及腸道菌群等的影響，旨在為該益生菌在肉鴨配合飼料中的應(yīng)用和研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

枯草芽孢桿菌(活菌數(shù)量為1×109CFU/g)由實(shí)驗(yàn)室分離篩選并制備；復(fù)合芽孢桿菌(含有枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，活菌數(shù)量≥3×1010CFU/g)由某公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取2周齡體重相近、健康的櫻桃谷肉鴨600只，隨機(jī)分為3組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50只。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加2 g/kg枯草芽孢桿菌(BS組)和1 g/kg復(fù)合芽孢桿菌(CB組)?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

預(yù)混料為每千克飼糧提供 Premix provided the following per kg of the diet: VA 8 000 IU，VD33 000 IU，VE 25 IU，VK34 mg，VB12.5 mg，VB25 mg，VB65 mg，VB120.01 mg，煙酸 nicotinic acid 50 mg，泛酸 pantothenic acid 20 mg，葉酸 folic acid 1 mg，生物素 biotin 0.03 mg，氯化膽堿 choline chloride 500 mg，Cu 10 mg，F(xiàn)e 30 mg，Zn 79.35 mg，Mn 63.6 mg，I 0.5 mg，Se 0.2 mg。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在武漢市農(nóng)科院試驗(yàn)鴨場進(jìn)行，采用發(fā)酵床網(wǎng)上養(yǎng)殖模式，自由采食和飲水，其他飼養(yǎng)管理措施、免疫程序按鴨場常規(guī)管理程序進(jìn)行。試驗(yàn)期為4周。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 生長性能測定

于試驗(yàn)的第1、2、3、4周末空腹稱重，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)抽取30只鴨逐只稱重，并記錄每周飼料消耗和死亡鴨只數(shù)，計(jì)算試驗(yàn)期間的平均日采食量、平均日增重、料重比和死亡率。

1.4.2 免疫器官指數(shù)和腸道菌群的測定

于42日齡時(shí)，每個(gè)重復(fù)選取3只，每組共12只體況相近的健康鴨屠宰，分別采集胸腺、脾臟及法氏囊，剔除脂肪后稱重，計(jì)算胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)。

免疫器官指數(shù)=免疫器官重量(g)/活重(kg)。

在超凈臺內(nèi)稀釋采集的盲腸內(nèi)容物，選擇2～3個(gè)適宜稀釋度分別接種于營養(yǎng)瓊脂、乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基(MRS)瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂平板(所用培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術(shù)有限公司)，測定菌落總數(shù)及乳酸菌、大腸桿菌數(shù)量；選擇2～3個(gè)適宜稀釋度，80 ℃水浴15 min后，接種于營養(yǎng)瓊脂平板，測定芽孢桿菌的數(shù)量。采用平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果用1 g腸道內(nèi)容物中細(xì)菌數(shù)量的對數(shù)值[lg(CFU/g)]表示。

1.4.3 腸道形態(tài)的測定

于42日齡時(shí)，每個(gè)重復(fù)選取3只，每組共12只體況相近的健康鴨屠宰，分別采集十二指腸、空腸和盲腸中段各2 cm組織樣，生理鹽水沖洗干凈，置于4%多聚甲醛溶液中固定，按照常規(guī)方法制作石蠟切片，每個(gè)腸段取5張不連續(xù)切片，每張切片隨機(jī)選5個(gè)典型視野(絨毛完整、走向平直)，選取5個(gè)最長絨毛測量絨毛高度、隱窩深度和黏膜厚度，并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度(V/C)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2007和SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌對肉鴨生長性能的影響

枯草芽孢桿菌對肉鴨生長性能的影響見表2。第3～6周，各組平均日增重、平均日采食量及料重比均呈現(xiàn)增加的趨勢。其中，第3周，BS組料重比顯著高于對照組(P<0.05)，CB組與BS組之間料重比差異不顯著(P>0.05)；第5周，對照組平均

日采食量極顯著高于BS組和CB組(P<0.01)，對照組料重比顯著高于BS組和CB組(P<0.05)；第6周，CB組平均日采食量極顯著低于對照組和BS組(P<0.01)。總體來看，第3～6周，對照組平均日采食量極顯著高于BS組和CB組(P<0.01)，對照組料重比顯著高于CB組(P<0.05)，各組之間平均日增重和死亡率差異均不顯著(P>0.05)。

由此可見，飼糧中添加枯草芽孢桿菌、復(fù)合芽孢桿菌均能夠促進(jìn)肉鴨后期生長發(fā)育。

2.2 枯草芽孢桿菌對肉鴨免疫器官指數(shù)的影響

枯草芽孢桿菌對肉鴨免疫器官指數(shù)的影響見表3。42日齡時(shí)，BS組和CB組的胸腺指數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)，各組之間脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)差異不顯著(P>0.05)，但BS組和CB組脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)均有增加的趨勢。

由此可見，飼糧中添加枯草芽孢桿菌、復(fù)合芽孢桿菌均能夠提高免疫器官指數(shù)，刺激肉鴨免疫器官發(fā)育。

表2 枯草芽孢桿菌對肉鴨生長性能的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表3 枯草芽孢桿菌對肉鴨免疫器官指數(shù)的影響

2.3 枯草芽孢桿菌對肉鴨腸道菌群數(shù)量的影響

枯草芽孢桿菌對肉鴨腸道菌群的影響見表4。42日齡時(shí)，BS組和CB組盲腸內(nèi)菌落總數(shù)和芽孢桿菌數(shù)量均顯著高于對照組(P<0.05)，大腸桿菌數(shù)量顯著低于對照組(P<0.05)，且BS組與CB組之間差異不顯著(P>0.05)；BS組乳酸菌數(shù)量顯著

高于對照組(P<0.05)，CB組略高于與對照組，但差異不顯著(P>0.05)。

由此可見，飼糧中添加枯草芽孢桿菌能夠促進(jìn)乳酸菌的生長，抑制大腸桿菌的繁殖，維持腸道微生物區(qū)系的平衡，促進(jìn)肉鴨生長。

表4 枯草芽孢桿菌對肉鴨腸道菌群數(shù)量的影響

2.4 枯草芽孢桿菌對肉鴨腸道形態(tài)的影響

枯草芽孢桿菌對肉鴨腸道形態(tài)的影響見表5。42日齡時(shí)，BS組和CB組肉鴨十二指腸的V/C極顯著高于對照組(P<0.01)，絨毛高度和黏膜厚度顯著高于對照組(P<0.05)；BS組隱窩深度顯著低于對照組(P<0.05)；CB組隱窩深度低于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。BS組和CB組肉鴨空腸的隱窩深度顯著低于對照組(P<0.05)，黏膜厚度顯著高于對照組(P<0.05)；CB組V/C顯著高于對照組(P<0.05)；BS組V/C略高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。CB組肉鴨回腸的V/C極顯著高于對照組(P<0.01)；BS組V/C略高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。

表5 枯草芽孢桿菌對肉鴨腸道形態(tài)的影響

續(xù)表5項(xiàng)目Items組別Groups絨毛高度Villusheight/μm隱窩深度Cryptdepth/μm絨毛高度/隱窩深度V/C黏膜厚度Mucosathickness/μm回腸Ileum對照組Controlgroup736.91±62.82107.48±11.566.89±0.60Bb857.01±57.38枯草芽孢桿菌組BSgroup758.96±71.81106.92±6.687.10±0.58ABab874.85±66.30復(fù)合芽孢桿菌組CBgroup770.33±58.67104.25±7.917.40±0.32Aa862.94±78.72

由圖1可見，BS組和CB組肉鴨絨毛結(jié)構(gòu)較整齊規(guī)則，層次分明，絨毛較長且緊密，隱窩較淺。對照組絨毛較短且稀疏，隱窩較深。

由此可知，飼糧中添加枯草芽孢桿菌、復(fù)合芽孢桿菌可以提高肉鴨十二指腸絨毛高度，降低十二指腸、空腸隱窩深度，提高十二指腸、空腸黏膜厚度，改善腸道結(jié)構(gòu)，促進(jìn)小腸發(fā)育。

A、B、C:對照組；D、E、F:枯草芽孢桿菌組；G、H、I:復(fù)合芽孢桿菌組；A、D、G:十二指腸；B、E、H:空腸；C、F、I:回腸。

A, B and C: control group; D, E and F: BS group; G, H and I: CB group; A, D and G: duodenum; B, E and H: jejunum; C, F and I: ileum.

圖1肉鴨十二指腸、空腸、回腸形態(tài)

Fig.1 Morphology of duodenum, jejunum and ileum of meat ducks (40×)

3 討 論

3.1 枯草芽孢桿菌對肉鴨生長性能的影響

許多研究表明，在肉鴨飼糧中添加適量的枯草芽孢桿菌可以提高飼料的利用率，改善肉鴨的生長性能[16,18-19]。本試驗(yàn)研究表明，在肉鴨飼糧中添加枯草芽孢桿菌能夠降低42日齡肉鴨后期(第5周)和全期(第3～6周)的平均日采食量和料重比。這與齊博等[20]研究結(jié)果相似。BS組和CB組前期(第3周)料重比較高，可能是芽孢桿菌在腸道內(nèi)定植以及對腸道微生態(tài)體系的調(diào)節(jié)作用需要一定的時(shí)間。此外，益生菌提高動物的生長性能主要是通過提供營養(yǎng)和消化酶[21]。芽孢桿菌能夠提供某些營養(yǎng)素、維生素K、維生素B12以及一些胞外酶和生長因子[22]。這些成分能夠改善腸道的消化功能，提高動物對飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。

3.2 枯草芽孢桿菌對肉鴨免疫器官指數(shù)的影響

胸腺、法氏囊、脾臟對于禽類的免疫功能至關(guān)重要。其中胸腺是中樞免疫器官之一，在誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞分化和成熟中起重要作用，法氏囊是禽類特異性的體液免疫器官。脾臟作為最大的外周免疫器官，主要參與機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫。Heckert等[23]指出，測量免疫器官重量是評價(jià)雞免疫狀況的常用方法。枯草芽孢桿菌可以在腸道內(nèi)產(chǎn)生多種有益物質(zhì)，如維生素、氨基酸類等，這些有益物質(zhì)可以促進(jìn)免疫器官的發(fā)育。本研究結(jié)果表明，飼糧中添加枯草芽孢桿菌對42日齡肉鴨胸腺的發(fā)育有顯著的促進(jìn)作用；對脾臟和法氏囊的發(fā)育也有一定的促進(jìn)作用，但是效果不顯著。這與趙娜等[24]的研究結(jié)果相似。然而另一些研究表明，肉鴨飼糧中添加益生菌可顯著增加法氏囊指數(shù)或者胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)[16,25]。免疫器官發(fā)育的差異可能與動物機(jī)體的健康狀況、益生菌在腸道產(chǎn)生的免疫活性成分、菌種的生物學(xué)特性以及添加的濃度有關(guān)。

3.3 枯草芽孢桿菌對肉鴨腸道菌群的影響

動物腸道微生物區(qū)系的平衡對于動物的生長發(fā)育有著直接的影響。在飼養(yǎng)管理中不可避免的會導(dǎo)致大腸桿菌、沙門氏菌、腸球菌等病原菌進(jìn)入畜禽腸道內(nèi)繁殖。進(jìn)入腸道的病原菌會通過產(chǎn)生毒素和有害物質(zhì)減少腸道微生物的種類與數(shù)量，降低腸道微生物的多樣性[26-27]。腸道微生物多樣性的減少會降低腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)和抵御病原菌的能力。研究表明，益生菌不僅能夠通過刺激先天或后天免疫系統(tǒng)，還可以通過調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞的通透性、黏液分泌以及分泌抗菌化合物增強(qiáng)機(jī)體抵抗病原菌[4]；此外，Li等[28]報(bào)道，芽孢桿菌能抑制腸道有害菌的繁殖，促進(jìn)腸道有益菌的生長。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加枯草芽孢桿菌能夠使肉鴨盲腸菌落總數(shù)及芽孢桿菌、乳酸菌的數(shù)量顯著增加，大腸桿菌的數(shù)量顯著下降。這說明枯草芽孢桿菌能夠在肉鴨腸道內(nèi)定植，通過促進(jìn)肉鴨腸道微生物區(qū)系的平衡，發(fā)揮益生功效。

另外，枯草芽孢桿菌發(fā)揮益生功效主要是由于其可以以芽孢的形態(tài)被動物攝入體內(nèi)，在腸道內(nèi)迅速增殖形成厭氧的環(huán)境，促進(jìn)乳酸菌、雙歧桿菌等厭氧有益菌的繁殖，通過降低腸道pH抑制病原菌的生長，通過分泌抗菌肽和細(xì)菌素類的抗菌活性物質(zhì)抑制病原菌的繁殖[29-30]，以及通過競爭排斥作用減少病原菌在腸道內(nèi)的定植等多方面共同作用來調(diào)節(jié)肉鴨腸道內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，從而促進(jìn)肉鴨的生長發(fā)育。

3.4 枯草芽孢桿菌對肉鴨腸道組織形態(tài)的影響

小腸在營養(yǎng)物質(zhì)吸收方面占據(jù)重要的位置。絨毛高度、黏膜厚度、隱窩深度是反映小腸功能的主要指標(biāo)。當(dāng)絨毛高度增加時(shí)，與小腸內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的接觸面積也相應(yīng)增加，從而增強(qiáng)對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力[31]。研究表明，益生菌在腸道內(nèi)的代謝產(chǎn)物(乳酸、琥珀酸、短鏈揮發(fā)性脂肪酸等)，除了用于宿主的能量需求，還會刺激黏膜層下的血管，促進(jìn)腸絨毛的發(fā)育。隱窩是腸細(xì)胞增殖、分化的地方，并且腸道隱窩從基部向絨毛方向不斷分化，促進(jìn)絨毛生長。隱窩深度會隨著基部細(xì)胞的生成率的變化而變化，生成率降低則隱窩深度變淺，進(jìn)而腸上皮細(xì)胞成熟率上升，增強(qiáng)對腸道營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的能力。此外，淺的隱窩深度會促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的快速更新以應(yīng)對致病菌的炎癥[32]。因此，V/C可以評價(jià)動物腸道生理的變化，V/C升高，表明腸黏膜結(jié)構(gòu)改善，消化吸收能力增強(qiáng)。益生菌促進(jìn)動物腸道黏膜結(jié)構(gòu)發(fā)育和改善主要是益生菌進(jìn)入動物腸道內(nèi)，能夠不斷的刺激腸道黏膜發(fā)育以及腸上皮細(xì)胞的更新，從而提高絨毛高度/隱窩深度；益生菌在腸道內(nèi)能夠通過競爭抑制以及產(chǎn)生一些抗菌肽、細(xì)菌素等代謝產(chǎn)物抑制有害菌的定植，減少對腸道黏膜的損傷，進(jìn)而促進(jìn)腸道健康。研究表明，在櫻桃谷鴨(28日齡)飼糧中添加益生芽孢桿菌能夠顯著提高十二指腸、空腸的絨毛高度、V/C以及降低十二指腸隱窩深度[16]。在臨武鴨飼糧中添加5.0×1010CFU/kg枯草芽孢桿菌，對空腸和回腸V/C有顯著影響[33]。本試驗(yàn)研究表明，飼糧中添加枯草芽孢桿菌能提高十二指腸絨毛高度和V/C，降低十二指腸、空腸隱窩深度。這表明枯草芽孢桿菌可以改善肉鴨腸道結(jié)構(gòu)，促進(jìn)小腸的發(fā)育，特別是十二指腸和空腸。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加枯草芽孢桿菌可以提高肉鴨的生長性能。

② 飼糧中添加枯草芽孢桿菌可以抑制肉鴨盲腸中有害菌的生長，促進(jìn)有益菌的增殖，維持腸道微生物區(qū)系的平衡，刺激免疫器官的發(fā)育。

③ 飼糧中添加枯草芽孢桿菌可以改善肉鴨腸道黏膜結(jié)構(gòu)，促進(jìn)小腸的發(fā)育。

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