馬衍旋 王文杰 穆淑琴 席靜寧, 李 寧 鄭 梓 閆 峻,3* 孫 超*

(1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，楊凌 712100；2.天津市農(nóng)業(yè)科學院，天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；3.天津大學化工學院，天津 300072)

脊椎動物的肌肉細胞與脂肪細胞已經(jīng)被確認來自共同的中胚層細胞，并且通過自分泌和旁分泌在調(diào)節(jié)動物的生長發(fā)育中有緊密的聯(lián)系[1-2]。研究脂肪與肌肉間的相互作用有助于探究細胞因子、營養(yǎng)因素和激素調(diào)節(jié)脂肪沉積與肌肉發(fā)育的作用機制。另外，脂肪與肌肉間的相互作用還可能將在人類新陳代謝的疾病機制和動物的肉質(zhì)性狀方面有廣泛的應(yīng)用。為了探討脂肪與肌肉組織在機體發(fā)育過程中的相互影響，許多研究者間接建立細胞培養(yǎng)體系。Dodson等[3]首次建立了3T3-L1前脂肪細胞與不同分化程度的羊肌肉細胞體外共培養(yǎng)體系。由于共培養(yǎng)體系比單獨培養(yǎng)細

胞能夠更好地模擬動物體內(nèi)的生理環(huán)境，因而受到學者們的廣泛關(guān)注。近年來，為了探討脂肪和肌肉組織在體內(nèi)發(fā)育過程中的相互作用。研究者們分別建立了綿羊、人、老鼠、天鵝和牛的脂肪與肌肉細胞的共培養(yǎng)體系[4-8]。本試驗通過分離培養(yǎng)豬骨骼肌衛(wèi)星細胞和肌內(nèi)前體脂肪細胞，進行體外間接共培養(yǎng)，研究2種細胞的增殖和分化特性，探討在間接共培養(yǎng)體系中豬肌肉細胞分化對脂肪細胞分化以及脂肪細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的調(diào)控作用，為進一步揭示脂肪與肌肉組織之間的相互作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

主要材料包括：0.25%胰酶消化液、0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)(1∶1使用，Sigma公司，美國)、臺盼藍、0.2%膠原酶、細胞凍存液、DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)、胎牛血清(Gibco公司，美國)、胰蛋白酶、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(北京索萊寶科技有限公司)、胰島素、地塞米松、特級馬血清(Gibco公司，美國)、青鏈霉素混合液(100×，北京索萊寶科技有限公司)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)(Sigma公司，美國)、油紅O、TacoTMDNA/RNA 取試劑盒(瑞基海洋生物科技股份有限公司)、PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司，日本)、All-in-OneTMqPCR Mix(GeneCopoeia公司，美國)、TGX Stain-FreeTMFastCastTMAcrylamide Kit(12%，Bio-Rad公司，美國)。

主要儀器包括：無菌培養(yǎng)皿、二氧化碳細胞培養(yǎng)箱、倒置熒光顯微鏡、Transwell細胞小室共培養(yǎng)板、SW-CJ-1D型超凈工作臺高速離心機、DT5-2型低速離心機、實時定量PCR儀。

1.2 試驗設(shè)計

3日齡健康大白仔豬購自天津市武清農(nóng)康生豬養(yǎng)殖有限公司，用于原代豬骨骼肌衛(wèi)星細胞和肌內(nèi)前體脂肪細胞分離。供試細胞分為2個組，即對照組(單獨培養(yǎng)肌內(nèi)前體脂肪細胞組)和試驗組(間接共培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細胞和肌內(nèi)前體脂肪細胞組)，每組4個重復(fù)。

1.3 試驗方法

1.3.1 豬骨骼肌衛(wèi)星細胞和肌內(nèi)前體脂肪細胞分離培養(yǎng)

無菌條件下，分離3日齡仔豬皮下背最長肌，去除背最長肌結(jié)締組織和血管，剪成1～2 mm3大小的組織塊，0.2% Ⅱ型膠原酶消化液37 ℃水浴消化2 h，200目網(wǎng)篩過濾，1 500 r/min離心5 min，棄上清液。用DMEM/F12培養(yǎng)液漂洗沉淀，經(jīng)400目網(wǎng)篩過濾，1 500 r/min離心10 min，棄上清液，再用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸細胞，接種到10 cm無菌細胞培養(yǎng)皿，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，利用差速貼壁法純化細胞，細胞培養(yǎng)2 h后，棄培養(yǎng)液，用PBS清洗貼壁細胞2次，得到純化的肌內(nèi)前體脂肪細胞[9]。骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離培養(yǎng)參照Yang等[10]和Yan等[11]的試驗方法。2種細胞分別接種到10 cm的無菌培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)液每2 d更換1次，細胞數(shù)量用血球計數(shù)板計數(shù)。

1.3.2 豬骨骼肌衛(wèi)星細胞和肌內(nèi)前體脂肪細胞鑒定

骨骼肌衛(wèi)星細胞鑒定：在培養(yǎng)皿中放入無菌蓋玻片進行細胞爬片，當細胞密度達到70%～80%時，分化培養(yǎng)基(2%馬血清+1%雙抗+DMEM/F12)培養(yǎng)3 d。棄掉分化培養(yǎng)基，PBS清洗3次，丙酮室溫固定20 min，PBS洗3次，Triton-X 100(1∶1 000)處理15 min，PBS洗3次，牛血清白蛋白(BSA)封閉2 h，加入Desmin抗體(1∶50)于4 ℃過夜，PBS洗3次，加入熒光標記的二抗(1∶2 000)于暗室中孵育1 h，PBS洗3次，最后1 μg/mL的4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核10 min(避光)，PBS洗3次，封片后熒光顯微鏡下觀察。

肌內(nèi)前體脂肪細胞細胞鑒定：培養(yǎng)皿中的細胞達到完全匯合，接觸抑制2 d，用含有10 μg/mL胰島素的完全培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化培養(yǎng)2 d，更換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 d，油紅O染色，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)[12]。

1.3.3 豬骨骼肌衛(wèi)星細胞和肌內(nèi)前體脂肪細胞共培養(yǎng)

2種原代細胞培養(yǎng)密度達到80%～90%時，0.25%胰蛋白酶37 ℃消化，DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細胞，記數(shù)后接種于Transwell細胞小室共培養(yǎng)板進行共培養(yǎng)。肌內(nèi)前體脂肪細胞以2.0×104個/cm2的密度接種于上室，骨骼肌衛(wèi)星細胞以1.0×105個/cm2的密度接種于下室，使用含有4%胎牛血清的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。待骨骼肌衛(wèi)星細胞密度達到80%時，更換含有2%馬血清的DMEM/F12培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化，48 h換液1次。待肌內(nèi)前體脂肪細胞接觸抑制2 d后，更換含有10 μg/mL胰島素的完全培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化培養(yǎng)2 d，更換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，直至出現(xiàn)肉眼可見明顯脂滴。

1.3.4 實時定量PCR

參照TaKaRa公司RNA試劑盒方法提取出總的RNA。第1條鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司(美國)。各基因及引物序列如下：過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)(5′-ACCACTCGCATTCCTTTGAC-3′，5′-CCACAGACT CGGCACTCAAT-3′)、CCAAT增強子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)(5′ -ATGGAGCAAGC CA ACTTCTAC-3′，5′-GCCAGGAACTCGTCGTTGAA-3′)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)(5′-CTCCTAACTGCTGAGCTGTCTCTCT-3′，5′-AGTCTTTCTCTTCAAT TCTTGCCT-3′)、脂肪酸合成酶(FAS)(5′-AAGGAGG AGTCAACGGG-3′，5′-GATGGTGAGGAGTCGGAT-3′)、脂蛋白脂酶(LPL)(5′-CGAAGTATTGGCATC CAGAAA C-3′，5′-TTGATCTCATAGCCCAAGTTGTT-3′)、β-肌動蛋白(β-actin)(5′-ACCAC AGCCGAGAGAGAAAT 3′，5′GACCTGACCATCAG-GGAGTT-3′)。PCR擴增引物均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR擴增的條件是95 ℃ 5 min，94 ℃ 60 s，55～60 ℃ 40 s， 72 ℃ 40 s (30個循環(huán))，72 ℃ 10 min 和4 ℃反應(yīng)結(jié)束，進行熔解曲線的繪制。利用2-ΔΔCt法進行相對實時定量分析。

1.3.5 免疫印跡試驗(Western Blot)

將培養(yǎng)的細胞在冰上用裂解緩沖液溶解，并在4 ℃、10 000×g離心10 min取上清液測定蛋白濃度。提取的總蛋白通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PGEA)進行分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)硝酸纖維膜上。并在膜上與一抗β-actin、C/EBPα、PPARγ、FAS、ACC(Abcom公司，英國)進行孵育，5%的脫脂奶粉封閉1 h。將膜與耦聯(lián)二抗37 ℃孵育1 h，使用化學發(fā)光液ChemiDoc XRS(Millipore公司，美國)和Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)進行檢測分析，分析灰度值，進行相對定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，利用單因素方差(one-way ANOVA)分析顯著性差異，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞形態(tài)及鑒定

2.1.1 骨骼肌衛(wèi)星細胞形態(tài)及鑒定

倒置顯微鏡下觀察原代肌衛(wèi)星細胞，細胞貼壁后逐漸形成梭形或紡錘形(圖1-A)；細胞相互融合后按一定方向呈有序排列(圖1-B)；細胞分化2 d后形成多核的肌管，核位于中央，肌管呈長條形，平行排列(圖1-C)。采用豬骨骼肌衛(wèi)星細胞的特異標記Desmin進行免疫熒光鑒定(圖1-D)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Desmin在細胞質(zhì)中的表達呈陽性，證實所培養(yǎng)的細胞為豬骨骼肌衛(wèi)星細胞(圖1-E、圖1-F)。

A、B、C：豬骨骼肌衛(wèi)星細胞培養(yǎng)；D：Desmin在細胞質(zhì)中免疫熒光染色；E：DAPI染色；F：D與E疊加。

A, B and C: porcine skeletal muscle satellite cell culture; D: Desmin immunofluorescence staining in cytoplasm; E: DAPI staining; F: the merge of A and B.

圖1豬骨骼肌衛(wèi)星細胞培養(yǎng)及鑒定

Fig.1 Culture and identification of porcine skeletal muscle satellite cells (100×)

2.1.2 肌內(nèi)前體脂肪細胞形態(tài)及鑒定

肌內(nèi)前體脂肪細胞貼壁生長，細胞接觸抑制2 d后(圖2-A)，改用誘導(dǎo)液Ⅰ誘導(dǎo)分化48 h，細胞逐漸變圓(圖2-B)，再用誘導(dǎo)液Ⅱ誘導(dǎo)分化48 h，然后換含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 d，在倒置顯微鏡下觀察，含有大量有脂滴樣的圓形細胞時用油紅O染色鑒定，結(jié)果顯示細胞內(nèi)出現(xiàn)了大量脂滴(圖2-C)。以上結(jié)果表明所培養(yǎng)的細胞為肌內(nèi)前體脂肪細胞。

圖2 豬肌內(nèi)前體脂肪細胞形態(tài)及鑒定

2.2 骨骼肌衛(wèi)星細胞對肌內(nèi)前體脂肪細胞脂質(zhì)沉積的影響

肌內(nèi)前體脂肪細胞誘導(dǎo)分化第8天，細胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴，經(jīng)油紅O染色后，對照組細胞中脂滴數(shù)量多，脂滴面積大(圖3-A)；試驗組細胞中脂滴數(shù)量較少，細胞著色明顯變淺、發(fā)暗(圖3-B)。

定量分析結(jié)果表明，共培養(yǎng)組的脂滴數(shù)量和脂滴面積都極顯著低于對照組(P<0.01)(圖3-C、圖3-D)。以上結(jié)果表明，骨骼肌衛(wèi)星細胞與肌內(nèi)前體脂肪細胞共培養(yǎng)下對肌內(nèi)前體脂肪細胞分化和脂質(zhì)沉積具有抑制作用。

A：對照組；B：共培養(yǎng)組；C：脂滴數(shù)量；D：脂滴面積。Control: 對照組 control group；co-culture：共培養(yǎng)組 co-culture group；數(shù)據(jù)柱標**表示差異極顯著(P<0.01)，下圖同。

A： control group ;B: co-culture group; C: lipid droplets number; D: lipid droplet area. Value columns with ** mean significant difference (P<0.01), the same as below.

圖3骨骼肌衛(wèi)星細胞對肌內(nèi)前體脂肪細胞脂質(zhì)沉積的影響

Fig.3 Effects of skeletal muscle satellite cells on lipid deposition in intramuscular preadipocytes (100×)

2.3 骨骼肌衛(wèi)星細胞對肌內(nèi)前體脂肪細胞增殖分化轉(zhuǎn)錄因子表達的影響

為了驗證骨骼肌衛(wèi)星細胞對肌內(nèi)前體脂肪細胞增殖分化的影響，檢測了肌內(nèi)前體脂肪細胞增殖分化轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα、PPARγ的基因和蛋白的表達水平。如圖4所示，共培養(yǎng)組肌內(nèi)前體脂肪細胞PPARγ、C/EBPα的基因和蛋白的表達水平極顯著低于對照組(P<0.01)。以上結(jié)果表明，骨骼肌衛(wèi)星細胞抑制肌內(nèi)前體脂肪細胞分化標志基因的表達。

A：肌內(nèi)前體脂肪細胞增殖分化標志基因表達水平；B：肌內(nèi)前體脂肪細胞增殖分化相關(guān)蛋白表達水平。PPARγ：過氧化物酶體增殖物激活受體γ；C/EBPα：CCAAT增強子結(jié)合蛋白α；Bata-actin: β-肌動蛋白。

A: intramuscular preadipocytes proliferation and differentiation marker gene expression level; B: intramuscular preadipocytes proliferation and differentiation related protein expression level. PPARγ: peroxisome proliferators-activated receptor γ; C/EBPα: CCAAT enhancer binding protein α; Bata-actin: β-actin.

圖4骨骼肌衛(wèi)星細胞對肌內(nèi)前體脂肪細胞增殖分化轉(zhuǎn)錄因子表達的影響

Fig.4 Effects of skeletal muscle satellite cells on proliferation and differentiation transcription factor expression of intramuscular preadipocytes

2.4 骨骼肌衛(wèi)星細胞對肌內(nèi)前體脂肪細胞脂質(zhì)代謝關(guān)鍵酶表達的影響

為了進一步研究豬骨骼肌衛(wèi)星細胞對肌內(nèi)前體脂肪細胞脂質(zhì)代謝的影響，檢測了豬肌內(nèi)前體脂肪細胞脂質(zhì)代謝關(guān)鍵酶FAS、ACC和LPL的基因和蛋白表達水平。如圖5所示，共培養(yǎng)組肌內(nèi)前體脂肪細胞FAS、ACC的基因和蛋白的表達水平極顯著低于對照組(P<0.01)，LPL的基因和蛋白的表達水平極顯著高于對照組(P<0.01)。以上結(jié)果表明，骨骼肌衛(wèi)星細胞抑制肌內(nèi)前體脂肪細胞脂質(zhì)代謝。

3 討 論

近年來，有使用肌細胞和脂肪細胞共培養(yǎng)的方法來研究細胞的生長特性和分泌功能。體外共培養(yǎng)的骨骼肌衛(wèi)星細胞和肌內(nèi)前體脂肪細胞對研究肌肉組織與脂肪組織的相互作用具有重要意義。Ailhaud等[13]報道，在胚胎發(fā)育過程中肌細胞與前體脂肪細胞聯(lián)系密切。Hausman等[6]首次嘗試直接將肌內(nèi)前體脂肪細胞和骨骼肌衛(wèi)星細胞混合培養(yǎng)。雖然這種培養(yǎng)方法接近體內(nèi)生長環(huán)境，但獲得的脂肪細胞較少并且混合其他類型的細胞。因此，混合培養(yǎng)的細胞不能用于試驗的定性和定量分析。Dodson等[3-4]研究表明，共培養(yǎng)的3T3-L1脂肪細胞和肌肉細胞可以促進脂肪細胞的存活、生長和增殖，抑制其分化。Yan等[11]研究了豬前體脂肪細胞和肌衛(wèi)星細胞體外直接共培養(yǎng)，檢測2種細胞增殖分化特征，結(jié)果表明共培養(yǎng)體系可以促進脂肪細胞的生長和增殖，同時抑制脂肪細胞分化。

A：肌內(nèi)前體脂肪細胞中脂質(zhì)代謝基因表達水平；B：肌內(nèi)前體脂肪細胞中脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達水平。FAS：脂肪酸合成酶；ACC：乙酰輔酶A羧化酶；LPL：脂蛋白脂酶；Bata-actin: β-肌動蛋白。

A: expression of lipid metabolism genes in intramuscular preadipocytes; B: expression of lipid metabolism related proteins in intramuscular preadipocytes. FAS: fatty acid synthase; ACC: acetyl CoA carboxylase; LPL: lipoprteinlipase; Bata-actin: β-actin。

圖5骨骼肌衛(wèi)星細胞對肌內(nèi)前體脂肪細胞脂質(zhì)代謝關(guān)鍵酶表達的影響

Fig.5 Effects of skeletal muscle satellite cells on lipid metabolism key enzyme expression in intramuscular preadipocytes

本研究探討了豬骨骼肌衛(wèi)星細胞與肌內(nèi)前體脂肪間接共培養(yǎng)體系下，肌內(nèi)前體脂肪細胞的分化特性。與共培養(yǎng)體系相比，單獨培養(yǎng)的肌內(nèi)前體脂肪細胞中脂滴數(shù)量多，脂滴面積大，定量分析表明共培養(yǎng)組的肌內(nèi)前體脂肪細胞中脂滴數(shù)量與脂滴面積都極顯著低于對照組。這表明肌細胞對肌內(nèi)前體脂肪細胞分化和脂肪沉積具有抑制作用，與Yan等[11]研究結(jié)果一致。有研究表明，F(xiàn)AS是乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甘油三酯的關(guān)鍵酶，調(diào)控哺乳動物體內(nèi)長鏈脂肪酸的合成。ACC是脂質(zhì)代謝中的關(guān)鍵酶，LPL是三酰甘油分解代謝中的關(guān)鍵酶，在脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要的作用[14]。PPARγ和C/EBPα在脂肪組織中具有很高的表達量，在脂肪形成和脂質(zhì)儲存中起著重要作用[8,15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在共培養(yǎng)體系下豬肌內(nèi)前體脂肪細胞PPARγ和C/EBPα的基因和蛋白的表達水平均極顯著降低，前體脂肪細胞FAS和ACC的基因和蛋白的表達水平也極顯著降低，而前體脂肪細胞LPL的基因和蛋白的表達水平顯著增加，表明共培養(yǎng)體系內(nèi)的豬骨骼肌衛(wèi)星細胞抑制了肌內(nèi)前體脂肪細胞的分化，促進了脂肪細胞分解代謝，證實了肌肉細胞對脂肪細胞發(fā)育的調(diào)控具有重要的作用[17-18]。

4 結(jié) 論

本試驗通過分離培養(yǎng)豬骨骼肌衛(wèi)星細胞和肌內(nèi)前體脂肪細胞，建立了骨骼肌衛(wèi)星細胞和肌內(nèi)前體脂肪細胞間接共培養(yǎng)體系，證實了共培養(yǎng)體系中骨骼肌衛(wèi)星細胞對肌內(nèi)前體脂肪細胞脂質(zhì)沉積具有抑制作用。

參考文獻：

[1] KOKTA T,DODSON M V,GERTLER A,et al.Intercellular signaling between adipose tissue and muscle tissue[J].Domestic Animal Endocrinology,2004,27(4):303-331.

[2] QUINN L S,STRAIT-BODEY L,ANDERSON B G,et al.Interleukin-15 stimulates adiponectin secretion by 3T3-L1 adipocytes:evidence for a skeletal muscle-to-fat signaling pathway[J].Cell Biology International,2005,29(6):449-457.

[3] DODSON M V,HOSSNER K L,VIERCK J L.Intercellular communication between muscle cells and 3T3-L1 preadipocytes[J].Basic & Applied Myology Bam,1996,6(6):503-512.

[4] DODSON M V,VIERCK J L,HOSSNER K L,et al.The development and utility of a defined muscle and fat co-culture system[J].Tissue & Cell,1997,29(5):517-524.

[5] DIETZE D,KOENEN M,R?HRIG K,et al.Impairment of insulin signaling in human skeletal muscle cells by co-culture with human adipocytes[J].Diabetes,2002,51(8):2369-2376.

[6] HAUSMAN G J,POULOS S P.A method to establish co-cultures of myotubes and preadipocytes from collagenase digested neonatal pig semitendinosus muscles[J].Journal of Animal Science,2005,83(5):1010-1016.

[7] SASAO N,HIRAYAMA E,KIM J.Formation and characterization of spontaneously formed heterokaryons between quail myoblasts and 3T3-L1 preadipocytes:correlation between differential plasticity and degree of differentiation[J].European Journal of Cell Biology,2004,83(1):35-45.

[8] CHOI S H,CHUNG K Y,JOHNSON B J,et al.Co-culture of bovine muscle satellite cells with preadipocytes increasesPPARγandC/EBPβgene expression in differentiated myoblasts and increases GPR43 gene expression in adipocytes[J].Journal of Nutritional Biochemistry,2013,24(3):539-543.

[9] 陳妍,張國華,陸會寧,等.八眉豬肌內(nèi)前體脂肪細胞的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化[J].廣東農(nóng)業(yè)科學,2014,41(13):110-113,123.

[10] YANG J J,LIY H,WANG K F,et al.Isolation,culture and biological characteristics of multipotent porcine skeletal muscle satellite cells[J].Cell and Tissue Banking,2017,18(4):513-525.

[11] YAN J,GAN L,YANG H L,et al.The proliferation and differentiation characteristics of co-cultured porcine preadipocytes and muscle satellite cellsinvitro[J].Molecular Biology Reports,2013,40(4):3197-3202.

[12] SUN C,QI R L,WANG L,et al.p38 MAPK regulates calcium signal-mediated lipid accumulation through changing VDR expression in primary preadipocytes of mice[J].Molecular Biology Reports,2012,39(3):3179-3184.

[13] AILHAUD G,P GRIMALDI A,NéGREL R.Cellular and molecular aspects of adipose tissue development[J].Annual Review of Nutrition,1992,12(1):207-233.

[14] LI X Z,YAN C G,YU J,et al.Dietary whole and cracked linseed increases the proportion of oleic and α-linolenic acids in adipose tissues and decreases stearoyl-coenzyme A desaturase,acetyl-coenzyme A carboxylase,and fatty acid synthase gene expression in the longissimus thoracis muscle ofYanbianyellow cattle[J].Journal of Animal Science,2017,95(2):718-726.

[15] FERRAND N,BéREZIAT V,MOLDES M,et al.WISP1/CCN4 inhibits adipocyte differentiation through repression of PPARγ activity[J].Scientific Reports,2017,7:1749.

[16] CHOI S K,PARK S,JANG S B,et al.Cascade regulation of PPARγ and C/EBPα signaling pathways by celastrol impairs adipocyte differentiation and stimulates lipolysis in 3T3-L1 adipocytes[J].Metabolism,2016,65(5):646-654.

[17] PARK S,BAEK K,CHOI C.Suppression of adipogenic differentiation by muscle cell-induced decrease in genes related to lipogenesis in muscle and fat co-culture system[J].Cell Biology International,2013,37(9):1003-1009.

[18] HAN H Y,WEI W,CHU W W,et al.Muscle conditional medium reduces intramuscular adipocyte differentiation and lipid accumulation through regulating insulin signaling[J].International Journal of Molecular Sciences,2017,18(8):1799.