張易祥 丁志麗 吳成龍 明建華 楊 霞 邵仙萍 孔有琴 葉金云

(水生動物繁育與營養(yǎng)國家地方聯(lián)合工程實驗室，浙江省水生生物資源養(yǎng)護與開發(fā)技術(shù)研究重點實驗室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院水生動物繁育與營養(yǎng)重點實驗室，湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖州 313000)

蛻皮激素具有類固醇激素典型的性質(zhì)，對甲殼動物體內(nèi)蛋白質(zhì)、糖類和礦物質(zhì)等的代謝具有激發(fā)、調(diào)節(jié)作用，可促進甲殼動物外骨骼生長形成，使甲殼動物快而順利地完成蛻皮。甲殼動物的蛻皮激素如蛻皮酮(E)、20-羥基蛻皮酮(20-HE)和25-脫氧蛻皮酮(25-DE)由Y-器官合成并分泌[1]。從20世紀70年代起，研究人員開始采用注射蛻皮激素的方法對甲殼動物的蛻皮生長進行研究，Warner等[2]發(fā)現(xiàn)注射適量蛻皮激素(2.14 μg/g)可以刺激螯蝦(Orconectesobscurus)較早地進行蛻皮，促進其生長。目前在生產(chǎn)和試驗研究中為加快生長和提高變態(tài)速率，縮短養(yǎng)殖周期，常通過飼料直接攝入外源蛻皮激素，提高甲殼動物的蛻皮頻率[3-6]。

露水草(CyanotisarachnoideaC.B.Clarke，C.arachnoidea)是提取蛻皮激素的優(yōu)良原料植物之一，是迄今發(fā)現(xiàn)含蛻皮激素最多的植物，它的蛻皮激素含量為干燥全草的1.2%，其地下部分蛻皮激素含量可達干重的2.9%[7]。與化學(xué)藥物添加劑相比，草藥無殘留或殘留低，且不產(chǎn)生耐藥性，同時兼有營養(yǎng)和藥用雙重作用[8-10]。

超微粉碎技術(shù)是通過機械設(shè)備對草藥進行研磨和撞擊，可將草藥的粒度加工至微米級。草藥經(jīng)超微粉碎有助于提高細胞破壁率、比表面積、有效成分溶出度，減少用藥量，節(jié)約藥材，保護資源[11-13]。

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)，又稱青蝦、河蝦，廣布我國內(nèi)陸水域，其肉味鮮美，富含營養(yǎng)，蝦肉中含蛋白質(zhì)16.9%、脂肪1.3%，還有鈣、磷、鐵和維生素等，已成為我國淡水名優(yōu)養(yǎng)殖品種之一[14]。長期以來，人們只知道蛻皮激素對甲殼動物的生長、發(fā)育和生殖有重要的作用[15]，但對其是否影響甲殼動物的非特異性免疫并不清楚，目前僅見Wu等[16]報道蛻皮激素參與調(diào)節(jié)凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)的免疫反應(yīng)，20-HE可影響凡納濱對蝦膽固醇的代謝，導(dǎo)致神經(jīng)反應(yīng)變化；當外源20-HE升高時，凡納濱對蝦的免疫反應(yīng)會降低。此外，將露水草制成粉體是否更有利于蝦蟹類對其有效成分的吸收利用也未見報道。為了探究露水草粉碎粒度和日本沼蝦對其蛻皮激素吸收利用的關(guān)系，以及蛻皮激素是否影響日本沼蝦的免疫反應(yīng)，本試驗利用超微粉碎技術(shù)，將干燥露水草加工成不同粒度的粉體，并以不同水平加入到日本沼蝦飼料中，研究日本沼蝦生長性能、肝胰腺消化酶活性和非特異性免疫指標的變化，以期對研發(fā)促進日本沼蝦生長、降低飼料系數(shù)且具有一定抗病性的新型高效無公害飼料添加劑提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計及飼料配制

試驗分2部分進行。試驗1：將不同粉碎粒度(粉碎粒度分別為10、30、50和180 μm)的露水草添加到基礎(chǔ)飼料中并使每千克飼料中蛻皮激素含量為10 mg，配制4種試驗飼料(分別命名為1#、2#、3#、4#)，并以不含露水草的基礎(chǔ)飼料為對照(命名為0#1)。試驗2：將粉碎粒度為180 μm(普通粉)的露水草以不同水平添加到基礎(chǔ)飼料中并使每千克飼料中蛻皮激素含量分別為3.30、6.60、13.20和26.40 mg，配制4種試驗飼料(分別命名為5#、6#、7#、8#)，并以不含露水草的基礎(chǔ)飼料為對照(命名為0#2)。

基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。不同粉碎粒度的露水草由長興清華粉體與新材料工程中心有限公司提供，粉碎粒度為10、30、50和180 μm露水草中蛻皮激素含量分別為0.74%、0.74%、0.74%和0.33%。其他飼料原料購于浙江璟寶飼料股份有限公司。按照試驗設(shè)計，每100 g基礎(chǔ)飼料中分別添加粉碎粒度為10、30、50、180 μm的露水草0.13、0.13、0.13、0.30 g，制成飼料1#、2#、3#、4#；每100 g基礎(chǔ)飼料中分別添加粉碎粒度為180 μm的露水草0.10、0.20、0.40、0.80 g，制成飼料5#、6#、7#、8#；對照飼料0#1和0#2即基礎(chǔ)飼料。試驗飼料具體制備方法如下：將原料粉碎后過60目篩，按配方準確稱取并逐級均勻混合，加入魚油和豆油再次混勻，最后加適量水混勻，用小型飼料造粒機制成粒度為1.0 mm的顆粒飼料，風干后置-20 ℃冰箱備用。

1.2 試驗動物與飼養(yǎng)管理

試驗用日本沼蝦幼蝦購自浙江德清吳越水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，幼蝦體長(1.71±0.07) cm，體重(0.08±0.01) g，體格健壯，活動迅速。

試驗用玻璃水族箱的規(guī)格為0.76 m×0.36 m×0.45 m，內(nèi)懸網(wǎng)片供日本沼蝦棲息與攀爬，試驗用水為儲水池曝氣自來水，水溫26～28 ℃，pH 7.6～8.1，溶氧濃度>6.5 mg/L，總氨氮濃度<0.01 mg/L。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

1)每千克維生素預(yù)混料含有Contained the following per kg of vitamin premix ：VA 4 200 000 IU，VC 60 g，VE 20 g，VD31 200 000 IU，VK 10 g，VB110 g，VB210 g，VB616 g，VB120.02 g，煙酸 nicotinic acid 50 g，葉酸 folic acid 4 g，肌醇 inositol 60 g，生物素 biotin 0.1 g，泛酸鈣 calcium pantothenate 35 g。

2)每千克礦物質(zhì)預(yù)混料含有Contained the following per kg of mineral premix：KCl 28 g，MgSO4·7H2O 100 g，NaH2PO4215 g，KH2PO4100 g，Ca(H2PO4)2·H2O 265 g，CaCO3105 g，C6H10CaO6·5H2O 165 g，F(xiàn)eC6H5O7·5H2O 12 g，ZnSO4·7H2O 4.76 g，MnSO4·H2O 1.07 g，AlCl3·6H2O 0.15 g，CuCl2·2H2O 0.24 g，CoCl2·6H2O 1.4 g，KI 0.23 g，α-纖維素 α-cellulose 2.15 g。

3)營養(yǎng)水平均為實測值。Nutrient levels were all measured values.

試驗用蝦馴養(yǎng)1周后，挑選大小均一的幼蝦2 100尾，隨機放入30個水族箱中，每個水族箱70尾。試驗開始后，每3個水族箱的幼蝦飼喂1種飼料，每天早、晚各投喂1次(早上投喂飼料的30%，晚上投喂飼料的70%)，投喂量為蝦體濕重的5%，投喂前用虹吸法吸取殘餌和糞便。每天換水1次，換水量為水體積的1/3。養(yǎng)殖試驗持續(xù)時間為60 d。

1.3 樣品采集

試驗進行至第60天時停飼1 d，各組試驗蝦計數(shù)、稱重，用于生長指標的分析和統(tǒng)計成活率。用1 mL無菌注射器每個重復(fù)采集20尾試驗蝦的血淋巴，與抗凝劑(由30 mmol/L枸椽酸鈉、0.34 mol/L氯化鈉、10 mmol/L乙二胺四乙酸、0.115 mol/L葡萄糖組成，pH 7.55)1∶2混合制成抗凝血。一部分抗凝血直接用于計數(shù)血細胞總數(shù)(THC)和測定血淋巴吞噬活性(HPA)；另一部分離心10 min(700×g、4 ℃)，所得的血漿于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于超氧化物歧化酶(SOD)和堿性磷酸酶(AKP)活性的測定。

將采血后的蝦置于冰盤內(nèi)于玻璃平皿上解剖，取肝胰腺剪開，預(yù)冷超純水(4 ℃、pH 7.0)清洗其內(nèi)容物，濾紙吸干后稱重，用于分析肝胰腺指數(shù)。稱重后的肝胰腺于-80 ℃超低溫保存，用于測定胃蛋白酶、類胰蛋白酶和淀粉酶活性。

1.4 指標測定

1.4.1 生長性能指標的測定

特定生長率(SGR，%/d)=100×

(ln末均重-ln初均重)/飼養(yǎng)天數(shù)；增重率(WGR，%)=100×(末均重-初均重)/初均重；肝胰腺指數(shù)(HSI，%)=100×肝胰腺均濕重/蝦體均濕重；成活率(SR，%)=100 × 試驗結(jié)束時存活蝦尾數(shù)/試驗開始時投放蝦尾數(shù)；飼料系數(shù)(FCR)=攝食餌料重/

(末均重-初均重)。

1.4.2 非特異性免疫指標的測定

利用血球計數(shù)板在光學(xué)顯微鏡(200×)下直接計數(shù)，計算出每毫升血淋巴中THC。

HPA的測定參考吞噬中性紅法[17-18]，計算公式如下：

HPA=100×吸光度值/1010個血細胞。

SOD和AKP活性的測定參照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進行。SOD以反應(yīng)體系中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的酶量為1個活性單位(U)。AKP以100 mL血漿在37 ℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個活性單位(U)。

1.4.3 消化酶活性的測定

將肝胰腺按其質(zhì)量分別加入10倍體積的預(yù)冷超純水，用玻璃勻漿器在冰浴中勻漿，3 000 r/min離心10 min，用考馬斯亮蘭法測定上清液中蛋白質(zhì)含量。所有消化酶活性的測定均按試劑盒(南京建成生物研究所生產(chǎn))說明書進行。

1.5 免疫保護試驗

攻毒用嗜水氣單胞菌TPS-30株由浙江省淡水水產(chǎn)研究所提供。預(yù)試驗確定日本沼蝦的的半致死濃度(LD50，7 d)為1×108CFU/mL。試驗進行至第61天時，從采樣后剩余蝦中每個重復(fù)隨機選取20尾,在其第2～3腹節(jié)間肌肉注射1×108CFU/mL嗜水氣單胞菌TPS-30株，注射量為0.02 mL/尾。攻毒后12 h恢復(fù)投喂試驗飼料，觀察并記錄7 d累積死亡結(jié)果，計算累積死亡率。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所測數(shù)據(jù)以3個重復(fù)數(shù)據(jù)的平均值±標準誤(mean±SE)表示，使用SPSS 15.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗顯著性，并采用Duncan氏法進行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 相同蛻皮激素含量下不同粉碎粒度露水草對日本沼蝦生長性能、肝胰腺消化酶活性及非特異性免疫指標的影響

相同蛻皮激素含量下不同粉碎粒度露水草對日本沼蝦生長性能、肝胰腺消化酶活性及非特異性免疫指標的影響見表2和表3。在飼料中蛻皮激素含量均為10 mg/kg的條件下，與不添加露水草的對照組相比，添加不同粉碎粒度露水草組(10 μm組、30 μm組、50 μm組和180 μm組)的WGR和SGR顯著升高(P<0.05)，F(xiàn)CR顯著降低(P<0.05)，HSI和SR變化不顯著(P>0.05)，肝胰腺中胃蛋白酶、類胰蛋白酶和淀粉酶活性差異不顯著(P>0.05)，非特異性免疫指標THC、HPA與血漿SOD和AKP活性差異不顯著(P>0.05)。添加不同粉碎粒度露水草組(10 μm組、30 μm組、50 μm組、180 μm組)之間上述生長性能指標、肝胰腺消化酶活性及非特異性免疫指標的差異均不顯著(P>0.05)。

表2 相同蛻皮激素含量下不同粉碎粒度露水草對日本沼蝦生長性能及肝胰腺消化酶活性的影響

同行數(shù)據(jù)肩標無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 相同粉碎粒度下不同蛻皮激素含量露水草對日本沼蝦生長性能、肝胰腺消化酶活性及非特異性免疫指標的影響

相同粉碎粒度下不同蛻皮激素含量露水草對日本沼蝦生長性能、肝胰腺消化酶活性及非特異性免疫指標的影響見表4和表5。在露水草粉碎粒度均為180 μm的條件下，與不添加露水草的對照組相比，6.60 mg/kg蛻皮激素組和13.20 mg/kg蛻皮激素組的WGR和SGR顯著升高(P<0.05)，F(xiàn)CR顯著降低(P<0.05)；26.40 mg/kg蛻皮激素組的WGR、SGR、SR和HPA顯著低于不添加露水草的對照組(P<0.05)，其WGR和SGR也顯著低于其他添加露水草組(P<0.05)；3.30 mg/kg蛻皮激素組、6.60 mg/kg蛻皮激素組、13.20 mg/kg蛻皮激素組之間的WGR和SGR差異不顯著(P>0.05)。各組日本沼蝦的HSI，肝胰腺胃蛋白酶、類胰蛋白酶和淀粉酶活性，THC以及血漿SOD、AKP活性的差異均不顯著(P>0.05)。

表3 相同蛻皮激素含量下不同粉碎粒度露水草對日本沼蝦非特異性免疫指標的影響

表4 相同粉碎粒度下不同蛻皮激素含量露水草對日本沼蝦生長性能及肝胰腺消化酶活性的影響

表5 相同粉碎粒度下不同蛻皮激素含量露水草對日本沼蝦非特異性免疫指標的影響

2.3 不同粉碎粒度或不同蛻皮激素含量露水草對日本沼蝦的免疫保護作用

由表6可知，試驗1中，攻毒后的累積死亡率各組之間均無顯著差異(P>0.05)。由表7可知，試驗2中，26.4 mg/kg蛻皮激素組攻毒后的累積死亡率和其他組相比顯著升高(P<0.05)，3.30 mg/kg蛻皮激素組、6.60 mg/kg蛻皮激素組、13.20 mg/kg蛻皮激素組以及對照組之間攻毒后的累積死亡率差異不顯著(P>0.05)。

表6 試驗1中各組日本沼蝦經(jīng)嗜水氣單胞菌處理后的累積死亡率

表7 試驗2中各組日本沼蝦經(jīng)嗜水氣單胞菌處理后的累積死亡率

3 討 論

本試驗所用粉碎粒度10、30、50 μm的露水草是通過超微粉碎技術(shù)得到的粉體。經(jīng)超微粉碎后的草藥不但有效成分溶出量、浸出率明顯提高[11-13]，而且粒度越小動物吸收效果越好[19-20]。已有研究結(jié)果表明，超微粉碎后的露水草蛻皮激素檢測值比普通粉(粉碎粒度180 μm)平均高1倍多，但粉碎粒度為10、30、50 μm的3種粉體之間無顯著差異[21]。李艷玲等[20]對黃連解毒散經(jīng)超微粉碎后和普通粉相比，發(fā)現(xiàn)雞對其有效成分小璧堿超微粉的吸收沒有增加，但對桅子苷超微粉吸收利用度增加了約44%，差異顯著。在本試驗1中，添加露水草粉組之間、粉體組與普通粉組之間日本沼蝦的生長性能、肝胰腺消化酶活性的差異并不顯著，說明日本沼蝦對蛻皮激素的吸收和露水草粉碎粒度的大小無相關(guān)性，并不是粒度越小吸收效果越好。由此可見，對每一種草藥應(yīng)通過試驗綜合確定其被動物吸收的最佳粒度，不能籠統(tǒng)認為所有草藥的超微粉在動物體內(nèi)的吸收都會增加。由于露水草的根莖纖細，超微粉的制作和普通粉相比成本高、收率低，所以日本沼蝦飼料中露水草粉碎粒度以普通粉為佳。

飼料中添加一定量的蛻皮激素或脫殼促生長素可促進中國對蝦[3-4]、羅氏沼蝦[5]、克氏原螯蝦[6]的蛻皮及生長。初始平均體重分別為1.95和3.30 g的中國對蝦飼料中添加蛻皮激素5.33～10.67 mg/kg[3]、初始平均體重為0. 3 g的羅氏沼蝦飼料中添加植物蛻皮激素2 mg/kg[5]、初始平均體重為8.31 g的克氏原螯蝦飼料中添加蛻皮激素0.50 mg/kg[6]均有明顯的促蛻皮和促生長作用。中國對蝦無節(jié)幼體飼料中添加類固醇激素17α-甲基睪丸酮300 mg/kg時，其幼體提前2 d全部進入仔蝦期，幼體的體長增長比對照組的增加了45.5%[4]。在本研究中，試驗1飼料中添加的10 mg/kg蛻皮激素和試驗2飼料中添加的6.60、13.20 mg/kg蛻皮激素對日本沼蝦均有顯著促生長作用，但肝胰腺中消化酶活性并沒有顯著改變，說明適量蛻皮激素對日本沼蝦的促生長作用是通過縮短脫殼時間、提高脫殼率來實現(xiàn)的；在飼料中蛻皮激素含量為26.4 mg/kg時，日本沼蝦的生長性能指標和免疫保護力明顯降低，其原因可能是過量蛻皮激素損害了日本沼蝦的正常脫殼生理。Hubschman等[22]研究了蛻皮激素對成年小長臂蝦的影響，注射劑量在0.25～5.00 μg/g時，對小長臂蝦有明顯的毒性作用。羅日祥等[3]的研究表明，中國對蝦飼料中蛻皮激素含量為60 mg/kg時會抑制其蛻皮、生長，乃至中毒。

許多草藥含調(diào)節(jié)水產(chǎn)動物免疫性能的有效成分，如有機酸類、生物堿、聚糖類、揮發(fā)油、蠟、甙、鞣質(zhì)物質(zhì)及一些未知免疫活性因子等，因而常常具有免疫增強作用[16,23-24]。Deng等[25]研究表明，冬蟲夏草中的多糖對凡納濱對蝦生長、免疫(酚氧化酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、溶菌酶活性)和抗氧化指標(SOD活性、還原型谷胱甘肽含量、活性氧水平、總抗氧化能力)有顯著的影響。露水草含甾酮、甾醇類物質(zhì)[26]，這些物質(zhì)對哺乳動物的免疫具明顯的調(diào)節(jié)作用，蛻皮甾酮可抑制抗免疫球蛋白E(IgE)誘導(dǎo)的組胺在大鼠肥大細胞中的釋放，并顯著降低刀豆蛋白A(ConA)引起的肥大細胞組胺釋放[27]。在本研究中，露水草對甲殼動物日本沼蝦的非特異性免疫指標(THC、HPA以及血漿SOD和AKP活性)和對細菌的抵抗力并無顯著增強作用，這可能和露水草所含甾酮、甾醇類物質(zhì)量少有關(guān)[26]。

甲殼動物的血細胞又稱血淋巴細胞，和免疫反應(yīng)有重要的關(guān)系，參與病原微生物的吞噬、凝集、包囊，血細胞吞入病原微生物后可通過氧化性殺菌機制和非氧化性殺菌機制殺死病原微生物[28]。在果蠅中，20-HE可促進血細胞的分化和增強造血功能，影響血細胞的數(shù)量，調(diào)節(jié)蛻皮激素激活通路[29]；但在凡納濱對蝦中，20-HE可使肝胰腺THC顯著降低[16]。在本研究中，露水草中的蛻皮激素對日本沼蝦的THC和HPA不但無顯著增強作用，而且過高含量(26.4 mg/kg)的蛻皮激素還使其HPA顯著降低。

AKP是甲殼動物溶酶體酶的重要組成部分[30]。SOD是一種重要的抗氧化酶，能催化超氧陰離子自由基(O2-·)發(fā)生歧化反應(yīng)形成過氧化氫(H2O2)，對于增強吞噬細胞的防御能力和整個機體的免疫功能有重大作用[30]。Wu等[16]研究表明，用20-HE處理凡納濱對蝦，肝胰腺中SOD活性顯著升高；高濃度20-HE抑制凡納濱對蝦O2-·的產(chǎn)生，低濃度20-HE促進O2-·的產(chǎn)生，作者認為可能是低濃度20-HE提高了煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性，產(chǎn)生活性氧，高濃度的作用相反。本試驗與上述凡納濱對蝦的研究結(jié)果并不相同，飼料中不同含量(3.30～26.40 mg/kg)的蛻皮激素對日本沼蝦的血漿AKP和SOD活性無顯著影響。

4 結(jié) 論

① 飼料中添加適量露水草(使飼料中蛻皮激素含量為6.60～13.20 mg/kg)對日本沼蝦具有顯著的促生長作用，日本沼蝦對蛻皮激素的吸收和露水草粉碎粒度無相關(guān)性。由于露水草超微粉的制作與普通粉相比成本高、收率低，因此認為日本沼蝦飼料中露水草以普通粉形式添加為佳。

② 露水草主要藥用成分蛻皮激素對日本沼蝦無免疫增強作用，且露水草蛻皮激素過量(飼料中蛻皮激素含量為26.4 mg/kg)還將導(dǎo)致日本沼蝦成活率和抗菌能力降低。

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