汪 悅 蔣林樹* 熊本海

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點實驗室，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

對于奶牛乳腺炎癥，特別是亞臨床乳腺炎的診斷通常是基于體細(xì)胞數(shù)(SCC)和細(xì)菌學(xué)檢查。SCC是基于牛奶中細(xì)胞總數(shù)量對炎癥進(jìn)行度量。細(xì)菌學(xué)檢查雖然可以指出感染的確切病因，但是耗時且需要經(jīng)驗豐富的人員操作?，F(xiàn)已經(jīng)提出聚合酶鏈反應(yīng)作為細(xì)菌學(xué)檢查的替代方法，檢測快速，但費用昂貴[1]。已有大量文獻(xiàn)對區(qū)分感染和未感染乳腺的幾種不同SCC臨界值進(jìn)行了評估和討論[2]。歐盟規(guī)定奶牛健康乳腺的SCC<200 000個/mL，而德國獸醫(yī)協(xié)會(DVG)建議將SCC閾值定為100 000個/mL[3-4]。我國的生鮮奶收奶標(biāo)準(zhǔn)為SCC<400 000個/mL[5]。不同的地域環(huán)境、自然氣候?qū)CC影響較大，且SCC會因哺乳期的狀況、年齡、擠奶的時間和頻率，特別是乳腺感染狀態(tài)而隨時發(fā)生變化[6]。因此，需要更為敏感的炎癥指示物來加強奶牛場乳腺炎的管理。最近有幾項研究揭示了鑒別牛奶中免疫細(xì)胞在診斷奶牛乳腺炎癥中的優(yōu)勢。Loken等[7]研究表明，除了SCC的確定外，體細(xì)胞的分型更有利于對奶牛乳腺的實際健康狀況進(jìn)行更詳細(xì)的描述。在乳腺中，乳免疫細(xì)胞的數(shù)量和分布在乳腺內(nèi)的炎癥反應(yīng)中起重要作用。淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)和抑制，通過入侵病原體的特異性生物膜受體識別抗原。巨噬細(xì)胞能夠攝取細(xì)菌、細(xì)胞碎片和殘留乳成分。多形核嗜中性白細(xì)胞(PMN)的主要任務(wù)是在急性炎癥過程開始時抵御入侵細(xì)菌。然而每種細(xì)胞類型的比例隨炎癥程度不同變化很大。Auldist等[8-9]研究表明，在健康牛奶中，巨噬細(xì)胞是主要的細(xì)胞類型，淋巴細(xì)胞是健康乳腺內(nèi)的主要細(xì)胞群體。不同的細(xì)胞分型技術(shù)對體細(xì)胞分型結(jié)果會造成一定的影響。Bannerman等[10]研究了不同病原體感染以及不同感染過程中的細(xì)胞模式。結(jié)果表明，以金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為主的病原體引起的急性炎癥乳腺中，PMN是主要的細(xì)胞類型，占乳腺總白細(xì)胞總數(shù)的90%。相比之下，在由凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)引起的慢性乳腺炎中，PMN數(shù)量甚至低于未感染乳區(qū)，而巨噬細(xì)胞數(shù)量較高。乳腺健康程度與泌乳性能有密切聯(lián)系，不同的病原體在乳腺中引起不同的免疫應(yīng)答。根據(jù)病因，在SCC變化趨勢和乳成分中都能觀察到明顯差異。盡管有關(guān)SCC與乳成分間關(guān)聯(lián)的文獻(xiàn)很豐富，但很少有研究涉及乳腺炎特定病原體與乳成分變化之間的關(guān)系。因此，本試驗通過研究不同牛奶SCC下牛奶體細(xì)胞分型特點，進(jìn)而對奶牛乳腺健康狀況以及奶牛泌乳性能做出更詳細(xì)的評估。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與樣品采集

本試驗采用的牛奶樣品采集自北京誠遠(yuǎn)盛隆養(yǎng)殖有限責(zé)任公司的荷斯坦奶牛。排除具有明顯臨床癥狀的奶牛(例如子宮炎、臨床乳腺炎、腹部置換、子宮脫垂、乳熱、臨床酮癥)。選擇102頭臨床健康荷斯坦奶牛[胎次(2～3胎)、泌乳天數(shù)(152±27) d、產(chǎn)奶量(27±3) kg/d]，收集牛奶樣品。收集時間為2017年6月5日，共擠奶2次，分別為08:00和19：00。采集牛奶樣品前，對乳腺外部進(jìn)行藥浴消毒，用單獨的毛巾擦拭清洗，然后再次用酒精清洗。棄去頭3把奶后，將約50 mL來自每頭奶牛4個乳區(qū)的牛奶樣品混合收集在無菌管中，隨后將牛奶樣品分裝成3個子樣品，分別用于牛奶體細(xì)胞分型、細(xì)菌學(xué)檢查及乳成分檢測，最后將所有樣品儲存于-80 ℃冰箱中。

1.2 試驗材料

1.2.1 主要儀器

流式細(xì)胞儀(NovoCyte 3130，美國ACEA公司)、微量加樣器和加樣頭、流式上樣管、15 mL離心管、離心機、乳成分分析儀(Fossomatic 5000、Milkoscan FT6000，丹麥FOSS公司)、恒溫培養(yǎng)箱[(36±1) ℃、(30±1) ℃]、冰箱(-80 ℃、2～5 ℃)、恒溫水浴鍋[(46±1) ℃]、電子天平(精度0.01 g)、微量移液器、無菌錐形瓶(250和500 mL)、無菌培養(yǎng)皿(直徑90 mm)、pH計(精度0.01)、菌落計數(shù)器。

1.2.2 主要試劑

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 牛奶SCC及乳成分

使用乳成分分析儀(Fossomatic 5000，丹麥FOSS公司)測定SCC。使用乳成分分析儀(Milkoscan FT6000，丹麥FOSS公司)在24 h內(nèi)測定乳脂、乳蛋白、乳糖、酪蛋白和尿素氮含量，采用脫脂乳通過反相-高效液相色譜(RP-HPLC)法測定乳蛋白組分含量[11]。

1.3.2 牛奶體細(xì)胞分型

使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行體細(xì)胞分型。取14 mL的牛奶加入15 mL的離心管中；690×g離心10 min。離心后，去掉上層的乳脂，然后棄掉上清。在離心管底加入1 mL的磷酸鹽緩沖液(PBS)，轉(zhuǎn)移到新的15 mL離心管中，并在離心管中加10 mL PBS，混勻，690×g離心10 min，棄掉上清；重復(fù)3次。細(xì)胞重懸在1 mL的PBS中。取400 μL細(xì)胞懸液于5 mL流式管1中，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。取100 μL細(xì)胞懸液于5 mL流式管2中，加入10 μL碘化丙啶(PI)，進(jìn)行活性檢測[12]。

1.3.3 牛奶菌落總數(shù)測定

分別稱取5.0 g胰蛋白胨、2.5 g酵母浸膏、1.0 g葡萄糖和15 g瓊脂，溶于1 000 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2，煮沸溶解，分裝于錐形瓶中，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，用以制備瓊脂培養(yǎng)基。稱取8.5 g食鹽，溶于1 000 mL蒸餾水中，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，用以制備無菌生理鹽水。用無菌微量移液器吸取1 mL牛奶樣品置于盛有9 mL無菌生理鹽水試管中，充分混勻，制成1∶10的樣品勻液。用微量移液槍吸取1 mL 1∶10的樣品勻液，緩慢注入盛有9 mL的無菌生理鹽水的無菌試管中，振蕩混勻，制成1∶100的樣品勻液。按此方法，制備10倍系列稀釋樣品勻液，共制備4個稀釋梯度，分別為1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000。在制備10倍遞增稀釋液時，吸取500 μL樣品勻液于無菌瓊脂平皿內(nèi)，每個稀釋梯度做2個平皿。同時，分別吸取500 μL空白稀釋液加入2個無菌瓊脂平皿內(nèi)作為空白對照。待瓊脂平板冷卻凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)并封口，在恒溫培養(yǎng)箱(36±1) ℃培養(yǎng)48 h[13]。參照GB 4789.2—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》統(tǒng)計菌落總數(shù)，菌落總數(shù)的計算公式為：

式中：N為菌落總數(shù)(個)；C為每個稀釋度的菌落數(shù)(個)；n為每個稀釋度的平行次數(shù)；d為稀釋因子(第1稀釋度)。

1.3.4 牛奶細(xì)菌學(xué)檢查

將每個牛奶樣品10 μL涂布到含有5%脫纖維蛋白綿羊血液的血瓊脂上。將平板在(37±1) ℃下有氧培養(yǎng)并在24和48 h后檢查。根據(jù)國家乳腺炎委員會指南(NMC，1999)鑒定細(xì)菌，其中包括形態(tài)學(xué)、革蘭氏染色、過氧化氫酶和凝固酶反應(yīng)、氧化酶反應(yīng)、生化特性和溶血模式。革蘭陽性細(xì)菌通過過氧化氫酶反應(yīng)劃分為葡萄球菌和鏈球菌。使用兔血漿中的凝固酶試管用于區(qū)分將金黃色葡萄球菌與CNS。通過氧化酶測試以及麥康凱瓊脂和曙紅亞甲基藍(lán)瓊脂上的生長特征鑒定革蘭氏陰性細(xì)菌[14]。

1.4 統(tǒng)計分析

使用Excel 2007對初始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和可視化。使用graPhPad Prism 6.01進(jìn)行圖表數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計算Pearson相關(guān)系數(shù)(r)。使用SAS 9.2中的MIXED程序分析體細(xì)胞分型與SCC、亞臨床乳腺炎特異性病原體以及乳成分之間的關(guān)聯(lián)。使用one-way ANOVE法進(jìn)行單因素方差分析，試用Duncan氏法進(jìn)行平均值的多重比較，P<0.05為差異顯著判定標(biāo)準(zhǔn)，P<0.01為差異極顯著判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛奶中的SCC及體細(xì)胞分型

由表1和表2可知，102份牛奶樣品中，SCC的平均值為351 720個/mL，其中有44份牛奶樣品SCC<100 000個/mL，劃分為低SCC組；有28份牛奶樣品SCC在100 000～400 000個/mL，為中等SCC組；有30份牛奶樣品SCC>400 000個/mL，為高SCC組。由表2可知，在102份牛奶樣品中，牛奶SCC為13 000～1 024 000個/mL，其中PMN的比例在4.48%～87.29%[(39.76±32.44)%]變化；淋巴細(xì)胞比例在3.37%～91.07%[(48.50±23.39)%]變化；巨噬細(xì)胞比例在2.37%～55.71%[(21.74±12.07)%]變化。

在體細(xì)胞群體中存在廣泛的細(xì)胞變異，特別是淋巴細(xì)胞和PMN。因此，試驗分析了體細(xì)胞分型與SCC的相關(guān)性。由圖1-a可知，SCC<200 000個/mL時，PMN比例較低，僅為27.4%，隨SCC的增加PMN比例顯著增加，當(dāng)SCC>400 000個/mL時，PMN比例高達(dá)87.29%，是炎癥牛奶樣品中的主要細(xì)胞群體；由圖1-b可知，當(dāng)SCC<200 000個/mL，淋巴細(xì)胞為主要的細(xì)胞群體，比例高達(dá)91.07%，隨SCC的增加淋巴細(xì)胞比例顯著減少；由圖1-c可知，巨噬細(xì)胞的比例在2.37%～55.71%，并且隨著SCC的增加，巨噬細(xì)胞比例并沒有出現(xiàn)與SCC有較強的相關(guān)性(r=-0.167 2，P>0.05)。

表1 牛奶樣品中的SCC

表2 牛奶樣品中體細(xì)胞類型分布

圖1 牛奶樣品中多形核嗜中性白細(xì)胞(a)、淋巴細(xì)胞(b)及巨噬細(xì)胞(c)的比例

為了測試奶牛健康乳腺內(nèi)免疫學(xué)狀態(tài)是否有統(tǒng)計學(xué)差異，將所有SCC<100 000個/mL的牛奶樣品根據(jù)SCC分為4組，Ⅰ組SCC為13 000～34 000個/mL，共9個樣品，Ⅱ組SCC為34 000～55 000個/mL，共11個樣品；Ⅲ組SCC為55 000～76 000個/ mL，共10個樣品；Ⅳ組SCC為76 000～100 000個/ mL，共14個樣品。

由圖2可知，在健康乳腺內(nèi)，隨著牛奶SCC升高，淋巴細(xì)胞比例降低，PMN比例升高。Ⅰ～Ⅲ組淋巴細(xì)胞比例(59.35%～81.26%)極顯著高于Ⅳ組(22.17%)(P<0.01)。4組之間巨噬細(xì)胞比例無顯著差異(19.15%～32.13%)(P>0.05)。Ⅰ～Ⅲ組的PMN比例(19.17%～31.22%)差異并不顯著(P>0.05)，但均極顯著低于Ⅳ組(82.68%)(P<0.01)。

**表示差異極顯著(P<0.01);*表示差異顯著(P<0.05);NS表示差異不顯著(P>0.05)。下圖同。

** indicated significant difference (P<0.01)； * indicated significant difference (P<0.05)；NS indicated no significant difference (P>0.05). The same as below.

圖2健康乳腺牛奶SCC范圍(≤100000個/mL)內(nèi)體細(xì)胞分型的比較

Fig.2 Comparison of differential cell counts within the SCC range of healthy mammary glands (SCC≤100 000 cells/mL)

2.2 牛奶中的菌落總數(shù)及細(xì)菌種類

由表3可知，牛奶樣品中的不同SCC之間，菌落總數(shù)差異較大。SCC<100 000個/ mL的牛奶樣品中，菌落總數(shù)只有8.08×104CFU/mL；在100 000～400 000個/mL的牛奶樣品，其菌落總數(shù)達(dá)到46.04×104CFU/mL；當(dāng)SCC>400 000個/ mL時，菌落總數(shù)急劇上升，已高達(dá)94.95×104CFU/mL。但各SCC牛奶樣品的菌落總數(shù)各均在正常范圍內(nèi)。

試驗檢測的102份牛奶樣品中，有13.72%的樣品為細(xì)菌培養(yǎng)陰性，83.34%為培養(yǎng)陽性，有3個樣品受到污染。根據(jù)引起奶牛乳腺炎病原體的傳播特點，將分離鑒定的細(xì)菌分類為傳染型、環(huán)境型和機會型病原體。由表4可知，在培養(yǎng)陽性的牛奶樣品中，分離出的機會型病原體為CNS(占總樣品的34.32%，占培養(yǎng)陽性樣品的39.77%)。而感染CNS的牛奶樣品中平均SCC為71 850個/mL；分離出的傳染型病原體(占總樣品的27.45%，占培養(yǎng)陽性樣品的31.81%)中金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)是最主要的病原體，感染傳染型病原體的牛奶樣品平均SCC為824 280個/mL。環(huán)境型病原體(占總樣品的21.57%；占培養(yǎng)陽性樣品的25.00%)包括變形菌屬(Proteusspp.)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellaspp.)、芽孢桿菌(Bacillusspp.)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)等，環(huán)境型病原體平均SCC為338 670個/mL。

表3 牛奶樣品中的菌落總數(shù)

2.3 牛奶中的不同病原體與體細(xì)胞分型

根據(jù)牛奶樣品中檢測到的不同乳腺炎病原體，分析了不同乳腺炎病原體狀態(tài)下的體細(xì)胞分型。將102份牛奶樣品分為3組：無病原體組、次要病原體組和主要病原體組。在102份牛奶樣品中有14個(13.72%)沒有檢測到病原體，即細(xì)菌培養(yǎng)陰性。在47個樣品(46.07%)中分離出主要病原體(如CNS、金黃色萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌)，而在24個樣品(23.53%)中檢測到次要的病原體(如芽孢桿菌、綠農(nóng)芽孢桿菌、肺炎克雷伯菌)。

由圖3可知，與主要病原體組牛奶樣品(31.45%)相比，無病原體組的牛奶樣品中淋巴細(xì)胞比例(59.48%)極顯著升高(P<0.01)，是健康乳

腺的主要細(xì)胞群體。牛奶樣品中巨噬細(xì)胞的比例(21.03%)沒有與病原體狀態(tài)呈現(xiàn)顯著相關(guān)性(P>0.05)。主要病原體組的牛奶樣品中PMN比例(48.93%)極顯著高于無病原體組(17.23%)(P<0.01)，顯著高于次要病原體組(P<0.05)。

表4 牛奶樣品中的細(xì)菌鑒定及分類

細(xì)菌比例數(shù)據(jù)括號外為細(xì)菌數(shù)量占總樣品(n=102)的比例，括號內(nèi)為細(xì)菌數(shù)量占培養(yǎng)陽性樣品(n=88)的比例。

Bacterial proportion data outside the brackets was the proportion of total samples (n=102), while that inside the brackets was the proportion of culture-positive samples (n=88).

雖然培養(yǎng)陰性樣品只有13.72%，但其平均SCC>200 000個/mL(表4)，因此對細(xì)菌培養(yǎng)陰性的14個牛奶樣品進(jìn)行進(jìn)一步的體細(xì)胞分型比較，根據(jù)SCC將其分為3組，即培養(yǎng)陰性-H組(無病原體生長且高SCC，SCC>400 000個/mL)(4個)、培養(yǎng)陰性-M組(無病原體生長且中等SCC，SCC 100 000～400 000個/mL)(5個)以及培養(yǎng)陰性-L組(無病原體生長且低SCC，SCC<100 000個/mL)(5個)。

由圖4可知，在培養(yǎng)陰性-L組中，淋巴細(xì)胞為優(yōu)勢細(xì)胞群體，比例顯著高于培養(yǎng)陰性-M組(P<0.05)，極顯著高于培養(yǎng)陰性-H組(P<0.01)。巨噬細(xì)胞比例在培養(yǎng)陰性-L組和培養(yǎng)陰性-H組中分別為53.1%和48.72%，而培養(yǎng)陰性-M組顯著低于其他2組(P<0.05)。PMN是培養(yǎng)陰性-H組和培養(yǎng)陰性-M組的主要細(xì)胞群體(72.48%、61.32%)，培養(yǎng)陰性-L組顯著或極顯著低于其他2組(P<0.05或P<0.01)。

圖3 不同病原體狀態(tài)下牛奶樣品中體細(xì)胞分型比較

圖4 培養(yǎng)陰性牛奶樣品中體細(xì)胞分型比較

2.4 產(chǎn)奶量及乳成分分析

由表5可知，產(chǎn)奶量為26.92 kg/d，變異性較大，變異系數(shù)(CV)為36.87%。在對乳成分的分析中發(fā)現(xiàn)，酪蛋白/乳蛋白是變異性最小的，CV為1.60%。通過RP-HPLC分析確定的詳細(xì)乳蛋白組分的CV都在15.80%～26.20%波動，乳鐵蛋白除外(CV為53.50%)。

2.5 奶牛乳腺健康狀況與產(chǎn)奶量、乳成分及蛋白組分的關(guān)系

由表6可知，與健康組相比，細(xì)菌培養(yǎng)陽性(傳染型、環(huán)境型和機會型病原體組)和培養(yǎng)陰性(培養(yǎng)陰性-L組、培養(yǎng)陰性-M組、培養(yǎng)陰性-H組)都對產(chǎn)奶量、乳成分及乳蛋白組分有不同程度的影響。與健康組相比，細(xì)菌培養(yǎng)陽性的牛奶樣品中，傳染型病原體危害最大；感染傳染型病原體的奶牛，產(chǎn)奶量顯著下降(P<0.05)，酪蛋白/乳蛋白及乳糖含量顯著減少(P<0.05)；對乳蛋白組分的也造成了不利影響，其中，乳蛋白、酪蛋白、αs1-酪蛋白及β-酪蛋白含量有所下降，但差異不顯著(P>0.05)。環(huán)境型病原體對β-酪蛋白含量的影響較大，使其顯著減少(P<0.05)。

與健康組相比，在培養(yǎng)陰性(培養(yǎng)陰性-L組、培養(yǎng)陰性-H組、培養(yǎng)陰性-M組)牛奶樣品中產(chǎn)奶量略有下降，但變化不顯著(P<0.05)；培養(yǎng)陰性-H組、培養(yǎng)陰性M組乳糖含量的顯著降低(P<0.05)，培養(yǎng)陰性-H組酪蛋白/乳蛋白顯著降低(P<0.05)，培養(yǎng)陰性-H組pH顯著升高(P<0.05)；對于乳蛋白組分而言，培養(yǎng)陰性-H組與培養(yǎng)陰性-M組中，酪蛋白、αs1-酪蛋白及β-酪蛋白含量顯著減少(P<0.05)，培養(yǎng)陰性-H組中，乳蛋白和αs2-酪蛋白含量顯著降低(P<0.05)。

表5 產(chǎn)奶量、乳成分及乳蛋白成分分析

表6 奶牛乳腺健康狀況與產(chǎn)奶量、乳成分及乳蛋白組分的關(guān)系

續(xù)表6項目Items健康Healthy平均值Mean標(biāo)準(zhǔn)誤SE培養(yǎng)陰性-LCulture-negative-L平均值Mean標(biāo)準(zhǔn)誤SE培養(yǎng)陰性-MCulture-negative-M平均值Mean標(biāo)準(zhǔn)誤SE培養(yǎng)陰性-HCulture-negative-H平均值Mean標(biāo)準(zhǔn)誤SE傳染型Contagious平均值Mean標(biāo)準(zhǔn)誤SE環(huán)境型Environmental平均值Mean標(biāo)準(zhǔn)誤SE機會型Opportunistic平均值Mean標(biāo)準(zhǔn)誤SE酪蛋白Casein/%2.840.032.860.052.860.042.850.052.880.042.890.042.890.04酪蛋白/乳蛋白Casein/milkprotein/%78.90a0.1078.6ab0.2078.50a0.2077.90c0.2078.48bc0.278.31bc0.2078.41bc0.20尿素Urea/(mg/kg)261.7014.60262.1015.80262.1015.10252.5015.70256.1015.00252.9015.40262.4016.00乳糖Lactose/%5.02a0.024.95ab0.044.92b0.034.65c0.044.89b0.034.86b0.034.89b0.04pH6.50b0.016.52ab0.026.51ab0.016.53a0.026.51ab0.016.50ab0.016.51ab0.02乳蛋白組成Milkproteincomposition/(g/L)乳蛋白Totalprotein44.45a0.3643.37ab0.7342.67abc0.5640.61c0.7243.50ab0.5143.26ab0.5943.57ab0.73乳清蛋白Wheyprotein7.000.086.930.196.700.146.490.186.900.136.780.156.970.19酪蛋白Casein37.46a0.3436.81ab0.6535.97bc0.5034.12c0.6436.58ab0.4636.49ab0.5336.62ab0.65αS1-酪蛋白αS1-casein12.45a0.1312.20abc0.2411.98bc0.1811.36c0.2412.19ab0.1712.15ab0.1912.18ab0.24αS2-酪蛋白αS2-casein3.73a0.053.71a0.113.64a0.083.25b0.113.62a0.073.67a0.093.54ab0.11β-酪蛋白β-casein14.11a0.1613.77ab0.2813.15bc0.2312.71c0.2813.65ab0.2113.40bc0.2413.59abc0.28κ-酪蛋白κ-casein4.450.054.460.124.330.094.230.124.330.084.370.094.390.12乳白蛋白Lactalbumin1.000.010.970.020.970.020.970.021.000.020.980.021.020.02乳球蛋白Lactoglobulin5.900.085.870.185.630.145.430.185.810.125.710.155.850.18乳鐵蛋白Lactoferrin0.0990.0040.0890.0070.1020.0060.0920.070.0920.0050.0960.0060.0990.007

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Values in the same row with the same or no small letter superscripts mean significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

3 討 論

奶牛乳腺內(nèi)感染(IMI)的診斷一直以來主要基于SCC和細(xì)菌學(xué)檢查。目前認(rèn)為SCC<100 000個/mL的牛奶樣品是健康的或處于正常的生理學(xué)范圍內(nèi)[14]。但近來有研究表明，在這些健康乳腺內(nèi)也可能已經(jīng)發(fā)生了炎癥反應(yīng)[15]。實際上，SCC在炎癥反應(yīng)的初始階段很低，直到入侵的病原體被釋放化學(xué)引誘物的免疫細(xì)胞識別，從而刺激PMN的遷移[16]。體細(xì)胞分型可能是監(jiān)測乳腺炎癥過程的一種更詳細(xì)的方法，因為它能夠識別出在炎癥過程中發(fā)生SCC增加之前相對細(xì)胞群體的變化。

3.1 牛奶中的SCC和體細(xì)胞分型

本研究結(jié)果表明，在SCC>400 000個/mL時，隨SCC增加，PMN比例顯著增加，成為乳腺內(nèi)的主要細(xì)胞群體，標(biāo)志著明顯的IMI。淋巴細(xì)胞作為健康乳腺內(nèi)的優(yōu)勢細(xì)胞群體，隨SCC增加而顯著減少。而巨噬細(xì)胞并未與SCC有顯著相關(guān)性。這一結(jié)果與Kester等[17]研究結(jié)果一致。而1項細(xì)胞分型研究表明，淋巴細(xì)胞在整個炎癥過程中的比例相當(dāng)穩(wěn)定，而巨噬細(xì)胞比例隨SCC增加而顯著下降[18]。這種不同的結(jié)果可能是由于不同的細(xì)胞分型技術(shù)間的差異造成。Geary等[19]通過研究技術(shù)因素對牛奶中體細(xì)胞分型的影響，結(jié)果顯示，采樣瓶的材質(zhì)對細(xì)胞數(shù)量有明顯影響，塑料材質(zhì)的離心管通過減少巨噬細(xì)胞的數(shù)量顯著影響了牛奶中巨噬細(xì)胞/淋巴細(xì)胞，原因在于巨噬細(xì)胞具有黏附性，它可以黏附到塑料材質(zhì)表面。淋巴細(xì)胞幾乎不受采樣瓶材質(zhì)的影響；另一個技術(shù)因素是牛奶樣品的離心次數(shù)。本試驗所使用的流式細(xì)胞術(shù)中牛奶樣品與單克隆抗體的組合需要4個離心步驟。有研究表明，離心次數(shù)顯著影響細(xì)胞分型結(jié)果。離心次數(shù)越少，淋巴細(xì)胞丟失越少，因為這些細(xì)胞密度低，巨噬細(xì)胞可以在乳脂層和離心牛奶的上清液中發(fā)現(xiàn)，因此巨噬細(xì)胞的比例相對穩(wěn)定，很少受到離心因素的影響[20]。體細(xì)胞分型可以通過流式細(xì)胞儀或光學(xué)顯微鏡獲得。Miller等[21]報道了PMN和淋巴細(xì)胞比例的鑒定結(jié)果在以上2種方法之間的相關(guān)性較高，而巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞比例的相關(guān)性較低。本試驗發(fā)現(xiàn)在健康乳腺和患病乳腺中巨噬細(xì)胞比例沒有顯著變化。Miller等[21]研究表明，巨噬細(xì)胞是健康乳腺主要的細(xì)胞群體。這2種結(jié)果的差異可通過對健康乳腺的不同定義來解釋。本試驗從SCC的角度定義健康乳腺，而Miller等[21]基于將細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果為陰性的乳腺定義為健康乳腺，但沒有指明任何SCC。另有一些研究指出，上皮細(xì)胞是未感染乳腺中發(fā)現(xiàn)的主要細(xì)胞類型[22]。Le Roux等[23]研究指出，鑒定巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞存在一定的難度，原因可能是上皮細(xì)胞是由巨噬細(xì)胞吞噬一些不能被消化的細(xì)菌或受到其他抗原物質(zhì)的長期刺激轉(zhuǎn)化而來。因此，二者的區(qū)分并不明顯，因而在計數(shù)過程中是有可能將一些巨噬細(xì)胞計數(shù)為上皮細(xì)胞。此外，由于上皮細(xì)胞的免疫學(xué)特性尚不清楚，因此本試驗沒有考慮上皮細(xì)胞的影響。

前人關(guān)于奶牛乳腺的研究幾乎都集中在感染乳腺上。而健康乳腺內(nèi)的免疫狀態(tài)鮮有涉及。本試驗研究結(jié)果表明，在SCC<100 000個/mL范圍內(nèi)，只有在極低SCC(13 000～76 000個/mL)的牛奶樣品中淋巴細(xì)胞比例高達(dá)59.35%～81.26%，是健康乳腺內(nèi)的優(yōu)勢細(xì)胞群體。當(dāng)SCC繼續(xù)升高，達(dá)到76 000～100 000個/mL時，PMN比例極顯著增加，達(dá)到82.68%，表明炎癥已經(jīng)開始發(fā)生，并且低于健康乳腺的SCC閾值。Leitner等[24]研究表明，SCC在6 250～25 000個/mL時，PMN比例僅為17.0%，而當(dāng)SCC增加到90 000個/mL時，PMN比例已升高到54.6%。牛奶中高PMN比例被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)，同時，PMN也可以成功地抵御病原體并預(yù)防乳腺炎。因而本試驗結(jié)果表明，在SCC<100 000個/mL時，乳腺內(nèi)早期炎癥過程可能已經(jīng)出現(xiàn)?？赡芤l(fā)PMN比例升高的另一個因素是壓力，然而本試驗沒有考慮壓力的因素，因為整個采樣過程中，均是奶牛保持在最佳條件下，并嚴(yán)格按照擠奶標(biāo)準(zhǔn)流程，因此奶牛沒有明顯的壓力癥狀。Dos Reis等[25]研究指出，體細(xì)胞分型是用于鑒定具有極低SCC的牛奶樣品中炎癥過程的有效工具。鑒于哺乳期乳腺不斷受到壓力以及免疫系統(tǒng)的影響，體細(xì)胞分型的短期重復(fù)性信息對于評估乳腺炎及炎癥控制方案中的適用性至關(guān)重要。

3.2 奶牛乳腺內(nèi)病原體狀態(tài)和體細(xì)胞分型

本試驗細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果顯示，在102份牛奶樣品中分離出的機會型病原體，即CNS占總樣品的34.32%，其對應(yīng)樣品的SCC為71 850個/mL，這說明在SCC<100 000個/mL時，PMN比例的顯著增加可能是因為大量CNS的存在，并且CNS有可能成為引發(fā)早期乳腺炎癥的潛在致炎病原體。傳染型病原體，特別是金黃色葡萄球菌的高比例出現(xiàn)與前人研究結(jié)果一致。這些樣品的平均SCC為824 280個/mL，說明傳染型病原體相比于其他2類病原體的致病力強，且病原體持續(xù)存在。約13.72%的培養(yǎng)樣品為培養(yǎng)陰性，然而，這些樣品的平均SCC為324 600個/mL，遠(yuǎn)大于100 000個/mL?？赡艿慕忉屖?，一些牛在采樣時處于愈合過程中，感染被自發(fā)消除。在這種情況下，即使炎癥反應(yīng)仍然活躍，病原體也會被清除。Mazal等[26]研究表明，由于CNS通常在乳頭皮膚上發(fā)現(xiàn)，一些培養(yǎng)陽性的樣品可能是由牛奶樣品采集期間的乳腺皮膚污染導(dǎo)致的，而不是真正的腺體感染。此外，在對這些牛奶樣品的細(xì)菌學(xué)檢查中可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果[27]。部分陰性細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果可能是因為病原體的間歇性脫落或脫落的量低于檢測方法的最低限度；也有可能是牛奶中抗菌劑或其他抑制劑的存在；在細(xì)菌培養(yǎng)陰性乳腺中，大多數(shù)細(xì)菌被吞噬或殺死，或者僅在宿主細(xì)胞內(nèi)存活才能存活，病原體大量減少或停止生長可能是陰性細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果的另一個原因[28]；此外，由于試驗所分析的牛奶樣品是4個乳區(qū)的復(fù)合牛奶樣品，因而一定比例的假陰性結(jié)果可能是由于健康乳區(qū)的稀釋效應(yīng)，所以受感染乳區(qū)的少數(shù)菌落無法通過細(xì)菌培養(yǎng)分析來檢測。因此，即使沒有細(xì)菌也存在炎癥過程，這一點可以通過增加的SCC和高比例出現(xiàn)的PMN得知。本試驗將培養(yǎng)陰性樣品根據(jù)SCC高低分為3組，在高SCC的培養(yǎng)陰性樣品中，炎癥狀態(tài)可能處于最高水平，但病原體被巨噬細(xì)胞吞沒，因此不能被分離鑒定出。在其他文獻(xiàn)中也有關(guān)于個體乳腺中的感染、炎癥過程和免疫反應(yīng)的相互依賴關(guān)系的討論[29]。

3.3 乳腺狀態(tài)與產(chǎn)奶量、乳成分及乳蛋白組成的關(guān)系

本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染傳染型病原體可顯著降低感染奶牛的產(chǎn)奶量，而環(huán)境型和機會型病原體引起的亞臨床乳腺炎感染所導(dǎo)致的產(chǎn)奶量的損失并不大。這與Politis等[30]研究結(jié)果一致。這可能歸因于為金黃色葡萄球菌的發(fā)病機、病原體的持續(xù)存在以及較低的治愈率。與健康乳區(qū)相比，金黃色葡萄球菌誘發(fā)的感染乳區(qū)，由于蛋白酶活性增加，降低生物合成以及炎癥反應(yīng)期間血-乳屏障的損害[31]。此外，在金黃色葡萄球菌誘發(fā)乳腺炎癥的牛奶中，發(fā)現(xiàn)乳蛋白含量的升高。其原因可能為炎癥的發(fā)生，導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)從血液流入乳腺。Py?r?l?等[32]研究表明，牛奶中乳脂、乳蛋白和酪蛋白含量不受引起亞臨床IMI的病原體影響。已有文獻(xiàn)報道了低產(chǎn)奶量與亞臨床IMI之間的關(guān)聯(lián)是由傳染型病原體和鏈球菌屬引起的。在這些研究中，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌引起的產(chǎn)奶量大幅下降。然而，金黃色葡萄球菌和克雷伯氏菌屬也會對初產(chǎn)和多產(chǎn)奶牛的產(chǎn)奶量產(chǎn)生負(fù)面影響，但CNS感染對牛奶生產(chǎn)沒有不利影響[33]。Piccinini等[33]研究指出，與未感染奶牛相比，通過鏈球菌誘導(dǎo)IMI后觀察到的牛奶中脂蛋比無顯著變化。而Riollet等[34]研究發(fā)現(xiàn)，感染和未感染乳區(qū)的比較表明，由不同細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、CNS、鏈球菌屬和棒狀桿菌屬)引起的IMI，其牛奶中總固形物、非脂肪固形物、乳脂、乳蛋白含量會發(fā)生不同程度的改變。此外，由于來自血液的可溶性蛋白質(zhì)的流入，葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌引起的臨床乳腺炎的乳蛋白含量較高。本試驗通過脫脂乳的RP-HPLC分析對乳蛋白組成的詳細(xì)分析發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白含量不受乳腺健康狀態(tài)的影響，但αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白和β-酪蛋白含量受到影響。具有高SCC的牛奶的特征具有更高的蛋白質(zhì)水解活性。在乳腺先天免疫反應(yīng)感染期間，纖溶酶原系統(tǒng)的激活導(dǎo)致β-酪蛋白降解成γ-酪蛋白和蛋白質(zhì)胨。因此，在本試驗中，培養(yǎng)陰性-H組中明顯炎癥狀態(tài)可能是高SCC牛奶樣品中酪蛋白的更多酶分解有關(guān)，這就解釋了與正常牛奶相比，培養(yǎng)陰性-H組中酪蛋白/乳蛋白降低了約1%。在感染環(huán)境型病原體的牛奶樣品中也觀察到顯著降低的β-酪蛋白含量。

通過鑒別乳免疫細(xì)胞在奶牛乳腺不同感染階段的比例在有助于對奶牛乳腺健康進(jìn)行更詳細(xì)的評估，但由于檢測技術(shù)的差異可能會導(dǎo)致檢測結(jié)果的偏差，體細(xì)胞分型的短期可重復(fù)性是十分重要的評判依據(jù)。此外，還應(yīng)考慮重復(fù)采樣以確定確切的感染階段。在今后的研究中，除了關(guān)注牛奶中免疫細(xì)比例的高低變化外，還應(yīng)更加注重免疫平衡這一概念，這對于保障奶牛健康有極其重要的意義。

4 結(jié) 論

① 體細(xì)胞分型可用于對奶牛乳腺健康狀況做出更詳細(xì)分析，特別是在低SCC的牛奶中更早地識別炎癥起始發(fā)生。

② 乳腺早期炎癥反應(yīng)的發(fā)生明顯低于目前公認(rèn)的健康乳腺牛奶SCC閾值(<100 000個/mL)，并且CNS可能是誘發(fā)早期乳腺炎癥的潛在病原體。

③ 細(xì)菌培養(yǎng)陰性樣品中，炎癥導(dǎo)致高SCC牛奶中酪蛋白/乳蛋白和乳糖含量的顯著降低。

參考文獻(xiàn)：

[1] HARMON R J.Physiology of mastitis and factors affecting somatic cell counts[J].Journal of Dairy Science,1994,77(7):2103-2112.

[2] HOWARD C J,NAESSENS J.Summary of workshop findings for cattle (tables 1 and 2)[J].Veterinary Immunology and Immunopathology,1993,39(1/2/3):25-47.

[3] KEHRLI K M,Jr.,SHUSTER D E.Factors affecting milk somatic cells and their role in health of the bovine mammary gland[J].Journal of Dairy Science,1994,77(2):619-627.

[4] KOESS C,HAMANN J.Detection of mastitis in the bovine mammary gland by flow cytometry at early stages[J].Journal of Dairy Research,2008,75(2):225-232.

[5] LEE C S,WOODING F B P,KEMP P.Identification,properties,and differential counts of cell populations using electron microscopy of dry cows secretions,colostrum and milk from normal cows[J].Journal of Dairy Research,1980,47(1):39-50.

[6] LEITNER G,ELIGULASHVILY R,KRIFUCKS O,et al.Immune cell differentiation in mammary gland tissues and milk of cows chronically infected withStaphylococcusaureus[J].Journal of Veterinary Medicine,2003,50(1):45-52.

[7] LOKEN M R,STALL A M.Flow cytometry as an analytical and preparative tool in immunology[J].Journal of Immunological Methods,1982,50(3):R85-R112.

[8] AULDIST M J,COATS S,SUTHERLAND B J,et al.Effects of somatic cell count and stage of lactation on raw milk composition and the yield and quality of Cheddar cheese[J].Journal of Dairy Research,1996,63(2):269-280.

[9] AULDIST M J,HUBBLE I B.Effects of mastitis on raw milk and dairy products[J].Australian Journal of Dairy Technology,1998,53(1):28-36.

[10] BANNERMAN D D,PAAPE M J,LEE J W,et al.EscherichiacoliandStaphylococcusaureuselicit differential innate immune responses following intramammary infection[J].Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology,2004,11(3):463-472.

[11] MAURMAYR A,CECCHINATO A,GRIGOLETTO L,et al.Detection and quantification of αs1-,αs2-,β-,κ-casein,α-lactalbumin,β-lactoglobulin and lactoferrin in bovine milk by reverse-phase high-performance liquid chromatography[J].Agriculturae Conspectus Scientificus,2013,78(3):201-205.

[12] LI N,ROMAIN R,MARIE-HéLNE P,et al.Flow cytometry approach to quantify the viability of milk somatic cell counts after various physico-chemical treatments[J].PLoS One,2015,10(12):e0146071.

[13] 王素英.細(xì)菌平板菌落計數(shù)的改進(jìn)方法[J].生物學(xué)通報,2003,28(2):41.

[14] 陳艷.微生物鑒定方法的比較[J].中國水產(chǎn),2005(1):69.

[15] HISS S,MUELLER U,NEU-ZAHREN A,et al.Haptoglobin and lactate dehydrogenase measurements in milk for the identification of subclinically diseased udder quarters[J].Veterinarni Medicina,2007,52(6):245-252.

[16] HORTET P,SEEGERS H.Calculated milk production losses associated with elevated somatic cell counts in dairy cows:review and critical discussion[J].Veterinary Research,1998,29(6):497-510.

[17] KESTER H J,SORTER D E,HOGAN J S.Activity and milk compositional changes following experimentally inducedStreptococcusuberisbovine mastitis[J].Journal of Dairy Science,2014,98(2):999-1004.

[18] KITCHEN B J.Review of the progress of dairy science:bovine mastitis:milk compositional changes and related diagnostic tests[J].Journal of Dairy Research,1981,48(1):167-188.

[19] GEARY U,LOPEZ-SHALLOO L,O’BRIEN B,et al.Meta-analysis to investigate relationships between somatic cell count and raw milk composition,Cheddar cheese processing characteristics and cheese composition[J].Irish Journal of Agricultural and Food Ressearch,2013,52(2):119-133.

[20] LABEN R C.Factors responsible for variation in milk composition[J].Journal of Dairy Science,1963,46(11):1293-1301.

[21] MILLER R H,PAAPE M J,FILEP R,et al.Flow cytometric analysis of neutrophils in cows’ milk[J].American Journal of Veterinary Research,1993,54(12):1975-1979.

[22] LE MARéCHAL C,THIéRY R,VAUTOR E,et al.Mastitis impact on technological properties of milk and quality of milk products-a review[J].Dairy Science & Technology,2011,91(3):247-282.

[23] LE ROUX Y,GIRARDET J M,HUMBERT G,et al.Proteolysis in samples of quarter milk with varying somatic cell counts.2.component PP3 and β-casein-lP (f29-105 and f29-107) of the proteose-peptone fraction[J].Journal of Dairy Science,1995,78(6):1298-1305.

[24] LEITNER G,MERIN U,SILANIKOVE N.Effects of glandular bacterial infection and stage of lactation on milk clotting parameters:comparison among cows,goats and sheep[J].International Dairy Journal,2011,21(4):279-285.

[25] DOS REIS C B M,BARREIRO J R,MESTIERI L,et al.Effect of somatic cell count and mastitis pathogens on milk composition in Gyr cows[J].BMC Veterinary Research,2013,9:67.

[26] MAZAL G,VIANNA P C,SANTOS M V,et al.Effect of somatic cell count on Prato cheese composition[J].Journal of Dairy Science,2007,90(2):630-636.

[27] MERIN U,FLEMINGER G,KOMANOVSKY J,et al.Subclinical udder infection withStreptococcusdysgalactiaeimpairs milk coagulation properties:the emerging role of proteose peptones[J].Dairy Science & Technology,2008,88(4/5):407-419.

[28] NEWBOULD F H S,NEAVE F K.The recovery of small numbers ofStaphylococcusaureusinfused into the bovine teat cistern[J].Journal of Dairy Research,1965,32(2):157-162.

[30] POLITIS I,NG-KWAI-HANG K F.Effects of somatic cell count and milk composition on cheese composition and cheese making efficiency[J].Journal of Dairy Science,1988,71(7):1711-1719.

[32] REKSEN O,S?LVER?D L,?STER?S O.Relationships between milk culture results and milk yield in Norwegian dairy cattle[J].Journal of Dairy Science,2007,90(10):4670-4678.

[33] PICCININI R,BINDA E,BELOTTI M,et al.Comparison of blood and milk non-specific immune parameters in heifers after calving in relation to udder health[J].Veterinary Research,2005,36(5/6):747-757.

[34] RIOLLET C,RAINARD P,POUTREL B.Cells and cytokines in inflammatory secretions of bovine mammary gland[M]//MOL J A,CLEGG R A.Biology of the Mammary Gland.Advances in Experimental Medicine and Biology.Boston,MA:Springer,2000.