雷婷婷，　張景勍， 張 雪，　張嚴(yán)方，　趙 華

（重慶醫(yī)科大學(xué) 重慶藥物高校工程研究中心，重慶 400016）

總姜黃素（Curcuminoids）是從植物姜黃（Curcum Longa L.）的根莖中提取的一種酸性的酚類色素，目前被廣泛，目前被廣泛用作食品著色劑和食品香料，主要包括姜黃素（Curcumin，Cur）、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素3種[1]，其中Cur在總姜黃素中含量最高，更易獲取。大量研究表明，Cur能抑制腫瘤細(xì)胞增殖與生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[2-4]，使得Cur成為抗腫瘤藥物研究熱點(diǎn)之一。此外，Cur還具有抗氧化、抗炎、降低血膽固醇等一系列藥理作用，且毒副作用小。然而，Cur存在水溶性差、生物半衰期短、口服生物利用度低等缺點(diǎn)，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受到限制[5]。

羥丙基-β-環(huán)糊精是一種低毒、安全、有效的藥用輔料，將Cur與羥丙基-β-環(huán)糊精制成包合物能改善藥物水溶性差等問題[6]。磷脂是生物膜的主要成分，廣泛用作藥物載體，能使藥物順利通過細(xì)胞膜，促進(jìn)藥物吸收［7］。研究表明，將多個(gè)藥物載體組合形成的新載體可能兼具單個(gè)載體的優(yōu)點(diǎn)［8］，羅見春等［9-10］制備并評(píng)價(jià)了 Cur羥丙基-β-環(huán)糊精磷脂復(fù)合物，考察了其藥動(dòng)學(xué)，結(jié)果表明將磷脂與羥丙基β-環(huán)糊精同時(shí)作為藥物載體增加了Cur的水溶性，提高了Cur的口服生物利用度。

在此研究基礎(chǔ)上，本研究利用納米乳能增加難溶性藥物的溶解度，使藥物在體內(nèi)有一定的緩釋作用等優(yōu)點(diǎn)［11］，同時(shí)采用了羥丙基-β-環(huán)糊精與磷脂2個(gè)藥物載體聯(lián)合應(yīng)用了包合物技術(shù)、磷脂復(fù)合物技術(shù)及納米乳技術(shù)，制備姜黃素新型納米乳（Curcumin novel nano emulsion， CNNE）， 可望能同時(shí)解決Cur水中溶解度低、生物半衰期短、口服生物利用度低等問題。本作者首次將Cur制備成CNNE，研究了CNNE的體內(nèi)藥代行為，為本課題組今后CNNE的研究奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1主要材料、試劑Cur，實(shí)驗(yàn)室自制，純度大于99%；羥丙基β-環(huán)糊精，江蘇泰興新鑫醫(yī)藥輔料有限公司產(chǎn)品；卵磷脂，德國Lucas Meyer公司產(chǎn)品；單辛酸甘油酯，河南正通化工有限公司產(chǎn)品；聚氧乙烯蓖麻油，南京都萊生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；PEG-400（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；氯仿（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；無水乙醇（分析純），重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司產(chǎn)品；甲酸（分析純），成都市科龍?jiān)噭S產(chǎn)品；甲醇（色譜純），美國天地有限公司產(chǎn)品。

1.1.2主要儀器與動(dòng)物AB204S電子分析天平，購于瑞士Mettler Toledo儀器公司；HWCL-3型集熱式恒溫磁力攪拌器，購于鄭州長城科工貿(mào)有限公司；G-16醫(yī)用離心機(jī)，購于北京白洋醫(yī)療器械有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，購于上海亞榮生化儀器廠；KQ2200B型超聲儀，購于昆山市超聲儀器有限公司；VOS-30A型真空干燥箱，購于施都凱設(shè)備（上海）有限公司；DDS-307A型電導(dǎo)率儀，購于上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；QL-901型旋渦混合器，購于海門市其林貝爾儀器制造有限公司；PHS-3C型pH計(jì)，購于上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；高效液相色譜儀，購于日本島津公司。

雄性 SD大鼠（250±20）g，由中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證書：SCXK渝2012-0005。

1.2　方法

1.2.1Cur對(duì)照品溶液的制備精密稱取Cur約10 mg，置100 mL的棕色容量瓶中，用甲醇溶解后稀釋至刻度，作為貯備液，精密量取Cur貯備液1 mL，置10 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得Cur對(duì)照品溶液。

1.2.2CNNE的制備稱取Cur 50 mg，羥丙基-β-環(huán)糊精187 mg，卵磷脂100 mg溶于20 mL無水乙醇中，置于50℃水浴中磁力攪拌3 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去無水乙醇，真空干燥得固體復(fù)合物。另分別稱取4.40 g單辛酸甘油酯、3.75 g PEG400、1.25 g聚氧乙烯氫化蓖麻油于燒杯，置于恒溫水浴鍋中攪拌混勻后加入85 mg固體復(fù)合物，待復(fù)合物完全溶解，緩慢滴入0.2 mL水，繼續(xù)恒溫水浴攪拌，待溶液變澄清后超聲除去氣泡，即得油包水型納米乳CNNE，外觀形狀為澄清、透明的黃色均一液體。

1.2.3CNNE電導(dǎo)率與pH的測定將制備的CNNE樣品分別采用電導(dǎo)率儀與pH計(jì)測定電導(dǎo)率與pH，重復(fù)測定3次，計(jì)算平均值。

1.2.4給藥方法和樣品收集12只雄性SD大鼠隨機(jī)平均分成受試組與參比組，給藥前禁食12 h，給藥途徑為口服灌胃給藥，受試組給予CNNE（相當(dāng)于Cur 50 mg/kg）［12-13］，參比組給予 Cur（50 mg/kg），2 組分別于給藥前取空白血，分別于給藥后不同時(shí)間點(diǎn)從大鼠眼底取血，收集的血液樣品置于含20 μL肝素的離心管中離心，6 000 r/min離心10 min，收集上層血漿，血漿放置-20℃保存，備用。

1.2.5血漿樣品的處理與制備精密量取血漿樣品 100 μL，加入甲醇 800 μL，渦旋 3 min 后，8 000 r/min離心10 min，吸取上清液，真空干燥揮去甲醇，用150 μL甲醇復(fù)溶，12 000 r/min離心5min，吸取100 μL上清液進(jìn)樣檢測。

1.2.6色譜條件色譜柱：Hypersil ODS2 C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm，大連依利特分析儀器有限公司產(chǎn)品）；柱溫：25℃；流動(dòng)相：甲醇-0.1%甲酸水溶液（66∶34，體積比）；流速：1.0 mL/min；檢測波長為 426 nm，進(jìn)樣體積：100 μL。

1.2.7血漿中CNNE含量測定的方法學(xué)考察

1）專屬性考察取空白血漿、Cur對(duì)照品、血漿樣品，按1.2.5項(xiàng)下“血漿樣品的處理與制備”中操作，按1.2.6項(xiàng)下“色譜條件”進(jìn)行分析。記錄色譜圖。

2） 線性關(guān)系考察精密量取 12、20、40、100、200、400、800、1 200、1 600 μL Cur對(duì)照品溶液分別至10 mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得Cur系列溶液。精密吸取空白血漿樣品100 μL，分別加入不同質(zhì)量濃度的Cur系列溶液100 μL，即得質(zhì)量濃度分別為 6、10、20、50、100、200、400、600、800 ng/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.5進(jìn)行操作，按1.2.6進(jìn)行分析，記錄峰面積。以Cur質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程。

3）回收率考察取空白血漿 100 μL，加入Cur對(duì)照品溶液，分別配制成低、中、高質(zhì)量濃度（10、100、600 ng/mL）的 Cur血漿樣品各5份，按 1.2.5項(xiàng)下“血漿樣品的處理與制備”中操作，按1.2.6項(xiàng)下“色譜條件”進(jìn)行分析，記錄峰面積，分別計(jì)算低、中、高質(zhì)量濃度（10、100、600 ng/mL）的平均峰面積Ar。另空白血漿100 μL，按1.2.5項(xiàng)下“血漿樣品的處理與制備”中操作后加入Cur對(duì)照品溶液，分別配制成分別配制成低、中、高濃度（10、100、600 ng/mL）的Cur血漿樣品各5份，按1.2.6項(xiàng)下“色譜條件”進(jìn)行分析，記錄峰面積，分別計(jì)算低、中、高質(zhì)量濃度（10、100、600 ng/mL）平均峰面積 As，以峰面積之比 （Ar/As）計(jì)算提取回收率；取空白血漿100 μL，加入Cur對(duì)照品溶液，分別配制成低、中、高濃度（10、100、600 ng/mL）的 Cur血漿樣品各 5 份，按1.2.5項(xiàng)下 “血漿樣品的處理與制備”中操作，按1.2.6項(xiàng)下“色譜條件”進(jìn)行分析，記錄峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的實(shí)際測得的質(zhì)量濃度（Cr），以實(shí)際測得的質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度之比（Cr/Cs），考察方法回收率。

4）精密度考察取空白血漿 100 μL，加入 Cur對(duì)照品溶液，配制成低、中、高質(zhì)量濃度（10、100、600 ng/mL）的Cur血漿樣品各5份，按1.2.5項(xiàng)下“血漿樣品的處理與制備”中操作，按1.2.6項(xiàng)下“色譜條件”進(jìn)行測定，考察該分析方法的日內(nèi)精密度，按此方法，連續(xù)測定3天，考察該分析方法的日間精密度。

5）血漿樣品穩(wěn)定性 精密量取空白血漿100 μL，加入Cur對(duì)照品溶液配成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（10、100、600 ng/mL）的血漿樣品各 5 份，室溫放置8 h、1 d、3 d后，按1.2.5項(xiàng)下“血漿樣品的處理與制備”中操作，按1.2.6項(xiàng)下“色譜條件”進(jìn)行測定，計(jì)算平均值與RSD，考察血漿樣品室溫穩(wěn)定性；精密量取空白血漿樣品100 μL，加入Cur對(duì)照品溶液配成低、中、高 3 個(gè)質(zhì)量濃度（10、100、600 ng/mL）的血漿樣品各 5份，-20 ℃冷凍保存 7、14、28 d后，按1.2.5項(xiàng)下 “血漿樣品的處理與制備”中操作，按1.2.6項(xiàng)下 “色譜條件”進(jìn)行測定，計(jì)算平均值與RSD，考察生物樣品-20℃凍存穩(wěn)定性。

1.2.8CNNE藥動(dòng)學(xué)與生物等效性的研究精密量取不同時(shí)間點(diǎn)的血漿樣品各100 μL，按1.2.5項(xiàng)下“血漿樣品的處理與制備”中操作，按1.2.6項(xiàng)下“色譜條件”進(jìn)行分析，測定血藥濃度，并繪制得血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線。采用藥動(dòng)學(xué)軟件DAS2.1.1對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，計(jì)算CNNE和Cur的房室模型與非房室模型主要藥代參數(shù)，并比較CNNE與Cur的生物等效性。

2　結(jié)果與討論

2.1CNNE的電導(dǎo)率與pH

油包水型CNNE外觀性狀為黃色澄明的均一液體，電導(dǎo)率為（4.81±0.01） μm/cm，pH 為 5.85±0.01。

2.2　血漿中CNNE含量測定方法學(xué)考察

2.2.1方法專屬性考察空白血漿、Cur標(biāo)準(zhǔn)品及血漿樣品色譜圖分別見圖1、圖2、圖3，結(jié)果表明，溶劑與血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)及空白制劑對(duì)Cur的測定無干擾。

圖1　空白血漿色譜Fig.1　Chromatogram of blank plasma

圖2　Cur對(duì)照品色譜Fig.2　Chromatogram of Cur standard

圖3　血漿樣品色譜Fig.3　Chromatogram of plasma sample

2.2.2線性關(guān)系考察以Cur峰面積 （A）為縱坐標(biāo)，Cur濃度（C）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，線性回歸方程為A=103.4C+296.11，r=0.999 9，結(jié)果表明，在6～800 ng/mL范圍內(nèi)峰面積與Cur質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。血漿中Cur的檢測限（S/N=3）為2 ng/mL，定量限為6 ng/mL。

2.2.3回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，血漿樣品中Cur低、中、高 3 個(gè)質(zhì)量濃度（10、100、600 ng/mL）的提取回收率與方法回收率均大于85%。結(jié)果表明，該分析方法的準(zhǔn)確度良好，能夠滿足體內(nèi)樣品含量測定對(duì)回收率的要求。

表1　血漿樣品中Cur的回收率（n=5）Table 1　Recovery of Cur in plasma

2.2.4精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，血漿樣品中Cur低、中、高 3 個(gè)質(zhì)量濃度（10、100、600 ng/mL）的日內(nèi)與日間的RSD均小于15%，表明該分析方法的精密度良好，能夠滿足體內(nèi)樣品分析的要求。

表2　血漿樣品中Cur日內(nèi)和日間精密度（n=5）Table 2　Inter-day and within-day precision of Cur in plasma

2.2.5漿樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，血漿樣品在室溫下放置3 d及-20℃凍存下放置28 d的RSD均小于15%，結(jié)果表明，樣品在室溫下放置3 d和-20℃凍存28 d均穩(wěn)定。

2.3　CNNE的藥代動(dòng)力學(xué)研究

SD大鼠口服灌胃給予Cur（reference）和CNNE（test）后，繪制血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線，見圖4。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖4看出，CNNE與Cur灌胃給藥后在大鼠體內(nèi)均有吸收、分布和消除過程，Cur的血藥質(zhì)量濃度Cmax低，在約20 h后大鼠體內(nèi)的血藥質(zhì)量濃度幾乎為零；但CNNE約20 h后仍有較高的血藥質(zhì)量濃度，且能在大鼠體內(nèi)平穩(wěn)緩慢地釋放藥物，當(dāng)Cur達(dá)到最大血藥質(zhì)量濃度時(shí)，CNNE仍處于吸收階段，在約5 h后CNNE的血藥質(zhì)量濃度達(dá)到最大，并能在較長時(shí)間內(nèi)能維持較高的血藥質(zhì)量濃度。

采用DAS 2.1.1軟件與統(tǒng)計(jì)矩法分別計(jì)算房室模型與非房室模型的主要藥代參數(shù)，見表4、表5。根據(jù)公式 （相對(duì)生物利用度=AUC受試組/AUC參比組×100%）計(jì)算CNNE的生物利用度。Tmax與Cmax采用實(shí)際測定值。

表3　血漿樣品中Cur的穩(wěn)定性（n=5）Table 3　Stability of Cur in plasma

圖4　CNNE與Cur口服后藥-時(shí)曲線（n=6）Fig.4　Concentration-time curves of CNNE and free Cur after oral administration

表4　CNNE與Cur的非房室模型主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n=6）Table 4　Non-compartmental model pharmacokinetic parameters of CNNE（n=6）

由表4非房室模型參數(shù)看出，CNNE的Cmax為（180.42±10.29） μg/L， 是 Cur的約 3 倍，Tmax為 （5±0），是 Cur的約 5 倍，MRT0-∞為（15.40±1.42） h，是Cur約2倍，CNNE與Cur的AUC0-∞分別為 （3410.20±154.09） （μg·h）/L 和（446.66 ±44.02） （μg·h）/L，計(jì)算得到CNNE的相對(duì)生物利用度是Cur的763.49%。

根據(jù) AIC（Akaike’s information criterion）最小和R2擬合度越接近1的原則判斷CNNE和Cur的房室模型，結(jié)果表明，CNNE與Cur均符合二室模型。由表5房室模型參數(shù)看出，CNNE口服灌胃后在大鼠體內(nèi)的Tmax約為5 h，是游離藥物Cur的約5倍，血藥質(zhì)量濃度Cmax約為180.42 μg/L，是游離藥物Cur的大約2.5倍，t1/2約10h，是游離藥物Cur的大約1.7倍，CNNE與Cur的AUC0-∞分別為（3 439.27±180.63） （μg·h）/L 和（482.07±42.14） （μg·h）/L，CNNE的相對(duì)生物利用度是Cur的713.44%。

采用房室模型與非房室模型計(jì)算得到的主要藥代參數(shù)基本一致，結(jié)果表明，將Cur制備成CNNE后促進(jìn)了Cur的口服吸收，增大了血藥質(zhì)量濃度，延長了藥物的達(dá)峰時(shí)間和生物半衰期，提高了Cur的生物利用度。

2.4　CNNE的生物等效性分析

CNNE的 AUC0-t和AUC0-∞經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后 [1-2α]90%置信區(qū)間分別為129.3% ～131.3%、129.9%～132.1%，均不在等效標(biāo)準(zhǔn)80%～125%范圍內(nèi)；CNNE的Cmax對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后 [1-2α]90%置信區(qū)間為130.6%～154.1%，不在等效標(biāo)準(zhǔn)70%～143%范圍內(nèi)；采用Tmax實(shí)際測定值，進(jìn)行Wilcoxon檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果表明，CNNE和 Cur的 Tmax有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P=0.001<0.05）。因此，按照生物等效性標(biāo)準(zhǔn)判定，CNNE與Cur不具有生物等效性。

3　結(jié)語

本研究建立了HPLC法測定CNNE大鼠血漿中Cur的含量，血漿中基質(zhì)與溶劑均對(duì)血漿樣品的測定均無干擾，該方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，能夠滿足體內(nèi)樣品分析的要求。多數(shù)文獻(xiàn)［12-14］中的色譜條件采用乙腈作為有機(jī)相，醋酸水溶液作為水相，醋酸含量0.5%～5%，本文中選用甲醇作為有機(jī)相，且用量少，從而降低了實(shí)驗(yàn)成本，水相中的甲酸用量少，且減少了色譜峰拖尾現(xiàn)象，從而改善了峰型，且制劑和血漿中的其他成分不影響Cur的測定。

本研究首次將磷脂與羥丙基-β-環(huán)糊精同時(shí)作為輔料，與Cur在一定條件下復(fù)合形成固體復(fù)合物。磷脂結(jié)構(gòu)中的氮原子有較強(qiáng)的失電子傾向，在一定條件下，與具有給電子能力的Cur中的羥基分子間作用力形成復(fù)合物，其中磷脂兩端的脂肪鏈不參與復(fù)合，脂肪鏈自發(fā)移動(dòng)包裹磷脂的極性基團(tuán)部位，形成具有親脂性的脂肪鏈表面，當(dāng)多個(gè)磷脂復(fù)合物分子按照此方式有序排列，從而最終形成具有疏水性的球狀物［15］，羥丙基-β環(huán)糊精分子的空腔內(nèi)部具有疏水性［16］，能夠?qū)ur與磷脂形成的疏水性分子包入其空腔內(nèi)，通過疏水性作用力、范德華力、氫鍵等分子間作用力形成穩(wěn)定的包合物，再制備成由水相、油相、乳化劑及助乳化劑按一定比例形成的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)均穩(wěn)定的澄明納米乳——CNNE，使得CNNE的理化性質(zhì)和生物特性較Cur均有不同程度的改變。

本實(shí)驗(yàn)藥代數(shù)據(jù)采用DAS2.1.1軟件與統(tǒng)計(jì)矩法所得，房室模型與非房室模型的主要藥代參數(shù)基本一致，房室模型與非房室模型的相對(duì)生物利用度分別為 713.44%、763.49%，羅見春等［10］將 Cur制成磷脂復(fù)合物生物利用度提高了約5倍，楊梅等［17］制成去甲氧基姜黃素納米乳生物利用度提高了約4倍，結(jié)果表明將Cur制成CNNE生物利用提高得更明顯，提高了約7倍，生物等效性分析結(jié)果表明CNNE與Cur不具有生物等效性。綜上所述，CNNE促進(jìn)了Cur的口服吸收，提高了Cur的生物利用度，具有重要的臨床意義。

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