陳積雄，黃曉燕，林文婷，何揚(yáng)利，符秀虹，曾敏，汪道文

(1 海南省人民醫(yī)院，?？?70030；2華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院)

內(nèi)皮細(xì)胞凋亡在心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展過程中起重要作用，是冠心病、心力衰竭等疾病的始動因素[1]?；ㄉ南┧峤?jīng)表氧化酶代謝可生成多種環(huán)氧二十碳四烯酸(EET)，對維持心血管系統(tǒng)穩(wěn)定至關(guān)重要[2,3]。研究證實(shí)，TNF-α可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；EET可抑制TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，但具體作用機(jī)制尚未闡明[4,5]。2016年5月～2017年5月，本研究觀察了花生四烯酸對TNF-α/放線菌素D(ActD)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室凍存細(xì)胞株；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液及生長因子、Annexin V-FITC試劑盒購自Life technologies。3-甲基腺嘌呤(3MA)、14,15-EET、微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅰ(LC3-Ⅰ)及微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)抗體、TNF-α、ActD購自Sigma公司；Caspse-8、Caspse-9活性檢測試劑盒購自B&D公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)采用含10% FBS的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，隔日換液，選用第4～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞隨機(jī)分成空白組、模型組、EET組及EET+3MA組?？瞻捉M常規(guī)培養(yǎng)；模型組、EET組及EET+3MA組均加入TNF-α(10 ng/mL)和ActD(5 ng/mL)誘導(dǎo)凋亡；誘導(dǎo)凋亡的同時(shí)EET組加入14,15-EET(100 nmol/L)； EET+3MA組加入14,15-EET (100 nmol/L)、3MA(2 mmol/L)。各組培養(yǎng)24 h時(shí)進(jìn)行以下研究。

1.3細(xì)胞凋亡檢測采用流式細(xì)胞儀。將上述各組細(xì)胞給予胰蛋白酶-EDTA消化，收集細(xì)胞至10 mL離心管中，低速離心后棄培養(yǎng)液。采用緩沖液漂洗細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL。取195 μL細(xì)胞懸液，加入PI和Annexin-v 5 μL，混勻后反應(yīng)25 min。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.4LC3-Ⅰ、 LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)檢測采用Western blotting法。將上述各組細(xì)胞采用冰PBS 洗滌，加入100 μL三去污細(xì)胞裂解液冰上裂解20 min；采用Bradford法測定樣品蛋白含量，調(diào)整蛋白濃度；取相同總量的蛋白樣品，加入加樣緩沖液，高溫凝固蛋白，加樣至SDS聚丙稀酰胺中，持續(xù)電泳直至染料到底部；4 ℃、25 V電壓下轉(zhuǎn)膜過夜；封閉液浸泡封閉膜2 h，采用TBS-T液洗膜4次；分別加入LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ一抗(工作液濃度均為1∶3 000)孵育過夜；采用TBS-T液洗脫，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ二抗(工作液濃度均為1∶1 000)，室溫孵育1 h；采用TBS-T液洗膜3次，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。采用Quantity One 圖像分析軟件對蛋白電泳條帶的灰度值定量分析，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

1.5Caspase-8、Caspase-9活性檢測采用ELISA法。收集上述各組細(xì)胞，250 g離心10 min；加入裂解緩沖液，冰上孵育10 min；10 000 r/min離心1 min，收集上清；在酶標(biāo)板中分別加入50 μL細(xì)胞裂解液、50 μL反應(yīng)緩沖液、5 μL反應(yīng)底物Caspase-8、Caspase-9；常溫孵育1～2 h，采用酶標(biāo)儀檢測Caspase-8、Caspase-9活性，以光密度(OD)值表示。具體步驟參照Caspase-8、Caspase-9活性檢測試劑盒說明書。

2　結(jié)果

2.1各組細(xì)胞凋亡率比較空白組、模型組、EET組及EET+3MA組細(xì)胞凋亡率分別為(0.22±0.11)%、(28.20±2.34)%、(8.23±1.14)%、(15.12±2.12)%，空白組、EET組及EET+3MA組細(xì)胞凋亡率均低于TNF-α組(P均<0.01)，EET+3MA組高于EET組(P<0.05)。

2.2各組細(xì)胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比較EET組及EET+3MA組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高于模型組、空白組(P<0.05或<0.01)；EET+3MA組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ低于EET組(P<0.01)。見表1。

表1　　　　各組細(xì)胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)

注：與空白組比較，#P<0.01；與TNF-α組比較，*P<0.05；與EET組比較，△P<0.01。

2.2各組細(xì)胞Caspase-8、Caspase-9活性比較模型組、EET組、EET+3MA組Caspase-8、Caspase-9活性均高于空白組，模型組高于EET+3MA組、EET組，EET+3MA組高于EET組，組間比較P<0.05或<0.01。見表2。

表2　各組細(xì)胞Caspase-8、Caspase-9活性比較

注：與空白組比較，#P<0.01；與TNF-α組比較，*P<0.05；與EET組比較，△P<0.01。

3　討論

自噬是細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程，是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象。研究表明，自噬現(xiàn)象在內(nèi)皮細(xì)胞中廣泛存在，抑制內(nèi)皮細(xì)胞自噬能夠促進(jìn)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷[4]。Chen等[5]報(bào)道，白藜蘆醇通過上調(diào)自噬，減少TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷；說明自噬是內(nèi)皮細(xì)胞存活及保持活力的自我調(diào)節(jié)方式之一，適度的自噬可能會保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，抑制細(xì)胞凋亡。

花生四烯酸是內(nèi)皮細(xì)胞富含的一種物質(zhì)。近年研究發(fā)現(xiàn)，花生四烯酸可通過細(xì)胞色素P450(CYP)表氧化酶代謝產(chǎn)生四種EET，分別為5,6、8,9、11,12和14,15-EET。EET通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)源性一氧化氮合酶表達(dá)，促進(jìn)NO釋放，發(fā)揮舒張血管、保護(hù)內(nèi)皮的生物學(xué)功能[8,9]；采用CYP2J2轉(zhuǎn)染或給予8,9-EET處理均可導(dǎo)致NF-κB、MMP-9表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，抑制主動脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用[10]。Dhanasekaran等[11]研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血處理20 min后應(yīng)用11,12-EET、14,15-EET可顯著縮小心肌梗死面積。上述研究提示，EET具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及損傷，抑制平滑肌細(xì)胞增殖，保護(hù)心肌細(xì)胞等作用，對維持心血管系統(tǒng)穩(wěn)定意義重大[2]。Yang等[3]在研究花生四烯酸抑制TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)現(xiàn)，花生四烯酸可能通過激活MAPK及PI3K/Akt等途徑抗細(xì)胞凋亡；但抑制了MAPK及PI3K/Akt等途徑并不能完全阻斷花生四烯酸的這種抗凋亡作用，提示花生四烯酸抗凋亡仍可能存在其他機(jī)制。Samokhvalov等[12]證實(shí)，EET能上調(diào)自噬，抑制饑餓誘導(dǎo)的內(nèi)皮凋亡，提示EET可能通過活化自噬途徑發(fā)揮抗凋亡作用。

本研究采用聯(lián)合TNF-α/ActD誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型。TNF-α是內(nèi)皮細(xì)胞凋亡研究中常用的誘導(dǎo)劑；ActD可抑制蛋白質(zhì)或RNA合成，即抑制抗凋亡基因的表達(dá)；聯(lián)合使用TNF-α/ActD能更好地誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[13]。本研究結(jié)果顯示，TNF-α/ActD誘導(dǎo)下內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡，加入14,15-EET后內(nèi)皮細(xì)胞凋亡減少，證實(shí)14,15-EET可抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，Beelinl/PI3K-Ⅲ復(fù)合體參與了自噬泡的形成和自噬的啟動；而3MA可通過抑制PI3K-Ⅲ復(fù)合體形成阻滯自噬的發(fā)生[14]。證實(shí)3MA是一種常用的細(xì)胞自噬阻滯劑。本研究中EET+3MA組加入3MA處理后，14,15-EET的抗凋亡作用明顯減弱，提示自噬可能在14,15-EET抗TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用。

Atg8是在酵母中發(fā)現(xiàn)的一種自噬發(fā)生必需的蛋白質(zhì)分子[15]。LC3是哺乳動物中ATG8-PE共軛體的同源物，LC3-Ⅱ是細(xì)胞質(zhì)中的LC3-Ⅰ經(jīng)過剪切等處理后的功能片段，為自噬泡形成所必需，其含量與自噬水平相關(guān)。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ是反映哺乳動物自噬水平公認(rèn)的指標(biāo)[16]。本研究結(jié)果顯示，在TNF-α誘導(dǎo)下內(nèi)皮細(xì)胞中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化，提示TNF-α誘導(dǎo)下內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生自噬，可能是內(nèi)皮細(xì)胞對外界損傷的一種保護(hù)機(jī)制。加入14,15-EET后，LC3-Ⅱ表達(dá)升高，進(jìn)一步說明14,15-EET促進(jìn)自噬。3MA、14,15-EET同時(shí)處理的內(nèi)皮細(xì)胞LC3-Ⅱ表達(dá)明顯抑制，說明14,15-EET誘導(dǎo)的自噬參與了抗凋亡作用。提示內(nèi)皮細(xì)胞通過激活自噬對抗外源性損傷。

盡管認(rèn)為自噬與凋亡在形態(tài)學(xué)、發(fā)生機(jī)制等多個(gè)方面均存在不同，但越來越多的研究提示,自噬與凋亡二者之間相互聯(lián)系及制約，其中關(guān)于Caspase家族與兩者關(guān)聯(lián)的研究最為廣泛。有研究者利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)Caspase-8表達(dá)以抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，但是相比未干擾細(xì)胞，干擾細(xì)胞中出現(xiàn)了更多的自噬小體，說明RNA干擾技術(shù)抑制Caspase-8表達(dá)的同時(shí)激活了自噬途徑[17]。Furuya等[18]發(fā)現(xiàn)自噬關(guān)鍵蛋白Beclin-1可通過提高Caspase-9活性而增加凋亡誘導(dǎo)劑引起的細(xì)胞凋亡，提示Caspase在自噬與凋亡交互作用中發(fā)揮重要作用。本研究TNF-α組細(xì)胞凋亡顯著增加的同時(shí)，Caspase-8、Caspase-9活性均明顯升高，提示二者在TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用。加入14,15-EET后二者活性明顯下降，說明14,15-EET可能通過抑制Caspase-8、Caspase-9發(fā)揮抗凋亡作用。EET+3MA組同時(shí)給予14,15-EET和3MA可抑制細(xì)胞自噬，Caspase-8、Caspase-9活性再次明顯升高，說明14,15-EET上調(diào)自噬的機(jī)制可能是抑制Caspase-8、Caspase-9活性。

綜上所述，花生四烯酸可抑制TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；通過抑制Caspase-8、Caspase-9活性誘導(dǎo)自噬可能是其作用機(jī)制。

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